人α-synuclein及其突變體的克隆、細(xì)菌表面展示與篩選.pdf

1、帕金森病(Parkinson’sdisease，PD)是最為廣泛的神經(jīng)退行性疾病之一，近年來(lái)對(duì)此疾病的研究越來(lái)越受到人們的重視。α-synuclein是synuclein蛋白家族成員之一，由140個(gè)氨基酸編碼組成，主要在腦組織中大量表達(dá)，是Parkinson病中特征性路易小體的主要組成部分。α-synuclein蛋白的聚集狀態(tài)的變化可能是影響帕金森病發(fā)生一個(gè)關(guān)鍵因素，而α-synuclein蛋白結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變受到許多遺傳學(xué)與細(xì)胞學(xué)因素的影響

2、。確定影響α-synuclein蛋白聚集的因素，明確α-synuclein存在的不同狀態(tài)以及在蛋白聚集過(guò)程中的相互關(guān)系，有助于人們最終在分子細(xì)胞水平上揭示帕金森病及其它神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生機(jī)制，尋找治療帕金森病更為有效的途徑。細(xì)菌表面展示技術(shù)的提出和廣泛應(yīng)用為α-synuclein的細(xì)菌表面正確折疊展示和靶分子的篩選及研究提供了重要的技術(shù)平臺(tái)和條件。 本文首先采用生物信息學(xué)手段對(duì)不同物種synuclein蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建分

3、子進(jìn)化樹，親緣關(guān)系分析；同時(shí)對(duì)人α-synuclein野生型蛋白及突變體A30P、E46K和A53T的二級(jí)結(jié)構(gòu)，三級(jí)結(jié)構(gòu)以及疏水性進(jìn)行分析；在此基礎(chǔ)之上，采用疊套PCR(overlapextension PCR)介導(dǎo)的點(diǎn)突變方法，以野生型α-synuclein為模板，克隆α-synucleinA30P、E46K和A53T3個(gè)突變型基因和采用PCR介導(dǎo)的連接方克隆α-synuclein剪接變體98，112和126；利用細(xì)菌親密素展示系統(tǒng)p

4、askint100對(duì)野生型α-synuclein及其突變體A30P、E46K和A53T進(jìn)行細(xì)菌表面的展示，并采用SDS-PAGE凝膠電泳和WesternBlot對(duì)外源蛋白α-synuclein進(jìn)行檢測(cè)和確定；最后利用展示在大腸桿菌細(xì)胞表面的α-synuclein篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，篩選與α-synuclein高度親和的特異性多肽分子。 進(jìn)化分析結(jié)果表明：synuclein家族蛋白可以聚為3類，各物種的α、β和γ各聚成一類。α

5、-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein屬于直系同源基因；而相同物種的α、β和γ-synuclein由基因復(fù)制而產(chǎn)生，屬于旁系同源基因，與直系同源的α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein基因相比則表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的距離。通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人類α-synuclein蛋白可以從序列上分為3個(gè)區(qū)域：N端(1-60)的兩性α螺旋區(qū)，主要包括膜結(jié)合區(qū)和疏水性NAC區(qū)，主要由6個(gè)“KTKEG

6、V”非完全重復(fù)序列組成；中間NAC(61-95)區(qū)域表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性；C端(96-140)則主要由酸性氨基酸組成。α-synuclein突變體A30P、E46K和A53T的突變位點(diǎn)位于α-synuclein基因的不同外顯子上。突變體A30P的88位突變堿基位于外顯子2上；而突變體E46K和A53T的突變位點(diǎn)則位于外顯子3。α-synuclein外顯子的異位拼接產(chǎn)生4種異構(gòu)體。5個(gè)外顯子都參與編碼一個(gè)由140個(gè)氨基酸組成的14.5kDa

7、的蛋白，這是α-synuclein在人體內(nèi)存在的主要形式；同時(shí)外顯子3和5在體內(nèi)存在選擇性剪接的機(jī)制，外顯子3或5的缺失，分別形成與140個(gè)氨基酸α-synuclein同框的126個(gè)氨基酸(13.1kDa)，112個(gè)氨基酸(11.4kDa)的剪接變體；而外顯子3和5的同時(shí)缺失則形成一個(gè)只編碼98個(gè)氨基酸的α-synuclein。 其次，采用疊套PCR介導(dǎo)的點(diǎn)突變方法和連接方法，以野生型α-synuclein為模板，成功獲得了α-

8、synucleinA30P、E46K和A53T3個(gè)突變型基因以及α-synuclein剪接變體98，112和126。 第三，以GFP為模型蛋白通過(guò)paskin100重組質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)菌表面展示、GFP蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和綠色熒光顯示確認(rèn)細(xì)菌親密素展示系統(tǒng)的正確性。在此基礎(chǔ)上將野生型α-synuclein及突變體A30P、E46K和A53T成功展示在大腸桿菌的細(xì)胞表面，SDS-PAGE凝膠電泳和WesternBlot檢測(cè)到外源α-syn

9、uclein蛋白目的帶的高效表達(dá)。 第四，利用展示在大腸桿菌表面α-synuclein篩選噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)，篩選與α-synuclein高度親和的特異性短肽，經(jīng)前兩輪的篩選，已收獲與α-synuclein結(jié)合的噬菌體肽庫(kù)，正用于進(jìn)一步的篩選和富集。 綜上，通過(guò)本研究得到如下初步結(jié)論：1)synuclein直系同源基因α-synuclein、β-synuclein和γ-synuclein基因表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系，而相同物

10、種由基因復(fù)制產(chǎn)生的旁系同源基因α、β和γ-synuclein則表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的距離；2)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人α-synuclein蛋白從序列上可分為3個(gè)區(qū)域：N端(1-60)的兩性α螺旋區(qū)；中間NAC(61-95)區(qū)：C端(96-140)；3)突變體A30P、E46K和A53T的突變位點(diǎn)位于不同的α-synuclein基因的外顯子上；4)外顯子3或5的缺失，分別形成與140個(gè)氨基酸α-synuclein同框的126個(gè)氨基酸(13.1kDa)

11、，112個(gè)氨基酸(11.4kDa)的剪接變體，而外顯子3和5的同時(shí)缺失則形成一個(gè)只編碼98個(gè)氨基酸的α-synuclein。不同突變和剪接形式的α-synuclein對(duì)α-synuclein蛋白的聚集速度存在一定的影響；5)通過(guò)疊套PCR介導(dǎo)的點(diǎn)突變和連接方法成功克隆α-synuclein突變型基因A30P、E46K和A53T及剪接變體98，112和126；6)通過(guò)GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)菌表面展示確認(rèn)了細(xì)菌親密素展示系統(tǒng)的正確性，實(shí)現(xiàn)