擬南芥黃萎病菌敏感型突變體的篩選與分析.pdf

1、棉花黃萎病是由黃萎病菌引起的一種土傳病害，世界各大棉區(qū)均有分布，我國的棉花黃萎病主要由大麗輪枝菌引起的。大麗輪枝菌寄主廣泛，且容易發(fā)生變異，致病力分化較明顯，致病機理復雜，目前缺乏有效的防治藥物，再加上抗源材料的匱乏，使得棉花黃萎病的防治變得愈加艱難。運用現(xiàn)代分子生物技術培育抗病棉品種將成為解決這一難題的一個可行途徑。當用大麗輪枝菌侵染擬南芥幼苗時，幼苗植株會出現(xiàn)子葉萎黃，花青素積累，植株發(fā)育矮小等典型的黃萎病癥狀。棉花的基因組龐大，生

2、長周期長等特點，使得發(fā)掘棉花抗性基因的進展緩慢。而模式植物擬南芥因為基因組小等優(yōu)點在研究棉花抗黃萎病的機制上具有很大的發(fā)展前景。
　　本研究將T-DNA庫的種子點于含瓊脂濃度為0.6％的MS培養(yǎng)基上，春化3 d，培養(yǎng)12 d后，將生長良好的幼苗移入土中，成熟后單株收種子并編號。因為課題組篩選的是敏感型突變體，而表型好的敏感型突變體多會因為發(fā)病嚴重而死亡。這個方法的優(yōu)點就在于即使表型好的突變體死亡，也可以根據事先的種子編號進行下步實

3、驗。將收到的種子按編號點在含瓊脂濃度為0.6%的MS培養(yǎng)基上，材料室生長8d后，將擬南芥幼苗擺在含瓊脂濃度為1%的MS培養(yǎng)基上，在幼苗的根尖處滴1μL濃度為5×105個孢子/mL的黃萎病菌孢子懸浮液，菌處理8-10 d，擬南芥幼苗開始出現(xiàn)黃萎病的癥狀，這些是對黃萎病菌敏感的突變體，將其移入土中觀察其在土中的生長情況。本實驗從突變體庫中篩選到3株能穩(wěn)定遺傳的突變體：sr1、s63和s133，這為研究棉花的抗黃萎病機制提供了實驗材料。正常培

4、養(yǎng)基上生長8d的突變體sr1在培養(yǎng)基上接種8-12d后發(fā)病較野生型WT嚴重，植株葉片先是褪綠，接著萎黃后枯黃，接種20d后，子葉干枯程度較WT嚴重，植株生長發(fā)育矮小。將接種9 d的幼苗移植到土壤生長22d后發(fā)現(xiàn)，和野生型WT相比其在土壤中生長受限，植株發(fā)育矮小，說明突變體sr1對黃萎病菌敏感。突變體sr1在培養(yǎng)基上病原菌處理12d后，從其葉片中分離的菌落形成數(shù)量是野生型的8倍，說明突變體sr1對黃萎病菌敏感的原因是由侵入其體內的菌落數(shù)量

5、所致。實驗還發(fā)現(xiàn)突變體萌發(fā)較野生型要慢，根長明顯短于野生型，抽薹時間比WT晚，后期生殖階段和WT的差異不顯著。土壤中生長30d后，二者地上部分的鮮重區(qū)別不大，同時統(tǒng)計了二者的根長，發(fā)現(xiàn)差異不明顯。進一步研究發(fā)現(xiàn)缺銨處理一定程度上能恢復突變體sr1的根長。實驗還發(fā)現(xiàn)突變體根短的原因是伸長區(qū)細胞長度變短所致。遺傳分析表明突變體sr1是單基因隱性突變，通過圖位克隆的技術分析得知該基因位于5號染色體上端。突變體s63在正常培養(yǎng)基上生長8d，用黃

6、萎病菌處理8 d后，子葉比野生型要先褪綠，接著萎黃；隨著接種處理時間的增加其子葉開始干枯，植株葉片干枯的數(shù)量也開始增多；同時植株花青素積累程度隨著時間的增加而加劇。接種40d左右，植株先于WT抽薹，生命周期縮短。土壤接種32d后，s63葉片萎蔫枯黃程度比WT明顯。培養(yǎng)基中接種18d后野生型WT的相對花青素含量是s63的1.4倍。菌處理9d后，子葉葉綠素含量下降幅度是野生型的2.5倍，結果表明突變體對黃萎病菌敏感。從突變體s63在培養(yǎng)基上

7、接種12d的葉片中分離出的菌落數(shù)量約是WT的7倍，說明突變體s63對黃萎病菌敏感的原因是由侵入其體內的菌落數(shù)量所致。臺盼藍染色結果表明培養(yǎng)基上處理8d的幼苗，其不管根尖還是子葉死細胞均多與野生型。這說明s63是對黃萎病菌敏感的突變體。突變體s133的表型與s63相似，培養(yǎng)基上黃萎病菌處理8 d后，子葉先于野生型褪綠萎黃，隨著處理時間的增加子葉開始干枯；同時花青素積累程度逐漸加劇。接種45 d后植株葉片干枯程度較WT嚴重，抽薹開花時間早于