PEG化免疫脂質復合物(PILP)介導雙基因對實驗性人肝癌的靶向性治療研究.pdf

1、第一章 PEG化的免疫脂質復合物:用于肝癌基因治療的新型非病毒基因遞送系統
　　 目的:為了對肝癌進行基因治療,我們研究了一種能夠在體內將治療基因遞送至肝癌細胞中的高效、安全的非病毒基因遞送系統。
　　 方法：聚乙二醇修飾的免疫脂質復合物(PILP),是一種新穎有效的非病毒基因遞送系統。PILP由DNA/聚乙烯亞胺(PEI25 kDa)多聚物及陰離子脂質體組成。分別以五個不同脂質/DNA摩爾比(50/1,90/1,130

2、/1,170/1和210/1)制備PILP。其中的陰離子脂質體由POPC,(DSPE)-PEG2000和(DSPE)-PEG2000-biotin組成,然后采用抗生物素-蛋白鏈菌素-單克隆抗體結合技術結合具尋靶作用的單克隆抗體。
　　 結果：該載體具有很強的保護質粒DNA不被核酸酶降解的能力,并且在4℃放置20天后,其粒徑和電位穩(wěn)定。以170/1的脂質/DNA摩爾比制備的PILP在體外有最高的轉染效率,平均粒徑和電位分別為132

3、 nm,+9.5 mV。這些復合物毒性小并能有效地將基因轉染肝癌細胞。4℃放置10天后,其體外轉染效率無顯著降低。用表達增強型綠色熒光蛋白和熒光素酶的質粒制備PILP,尾靜脈給藥,在體內表現出靶向肝和腫瘤的基因表達,而不同于PEI/DNA聚合物基因表達的肺部靶向性。
　　 結論：PILP是一種靶向肝細胞癌的基因遞送載體。
　　 第二章靶向hEGFR mRNA和 hTERT mRNA小干擾聯合基因治療
　　 目的:

4、將靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的shRNA-pDNA分別制備成PEG化的免疫脂質復合物(PILP),考察針對這兩種基因聯合治療肝細胞癌的效果。
　　 方法：(1)將編碼靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的小發(fā)夾RAN(shRNA)的表達質粒anti-hEGFR pDNA和anti-hTERT pDNA制備成免疫脂質復合物8314/shRNA-pDNA/PILP(8314/anti-unrelated

5、 pDNA/PILP,8314/anti-hEGFR pDNA/PILP和8314/anti-hTERT pDNA/PILP),PILP制備時,使用小鼠對人胰島素受體的83-14單克隆抗體(8314 MAb)。體外轉染肝癌SMMC-7721細胞,4天后,采用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡,采用RT-PCR檢測hEGFR基因水平。觀察各組8314/shRNA-pDNA/PILP對hEGFR表達的抑制作用并于4個不同的時間點(2,4,6 da

6、y)觀察8314/anti-hEGFR/PILP的時間-效應關系。(2)將2000,000個肝癌SMMC-7721細胞種于裸鼠背部皮下10天后,每5天靜脈注射進行基因治療,每只裸鼠尾靜脈注射8314/shRNA-pDNA/PILP40μg,聯合治療組同時注射8314/anti-hEGFR/PILP和8314/anti-hTERT pDNA/PILP各40μg,記錄各組荷瘤鼠存活時間,計算腫瘤抑制率。連續(xù)給藥5次后,使用免疫組化和West

7、ernBlot技術檢測腫瘤組織的hEGFR蛋白水平,其基因水平檢測使用實時定量RT-PCR法。
　　 結果：(1)將8314/anti-hEGFR pDNA/PILP復合物單獨或與8314/anti-hTERT pDNA/PILP復合物共轉染細胞可誘導hEGFR序列特異性基因沉默效應,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡得到了一致的結果。轉染SMMC-7721細胞4天后,細胞周期結果表明8314/anti-hTERT pDNA/PILP

8、處理組和共轉染組的G0/G1期細胞百分數較對照組分別增加了17.62％和45.62％,進入S期的細胞百分數較對照組分別減少了35.49％和87.55％。細胞凋亡結果表明8314/anti-hEGFR pDNA/PILP處理組和共轉染組細胞總凋亡率分別為12.47％和29.59％。與對照組比較,8314/anti-hTERT pDNA/PILP處理組和共轉染組hEGFR基因水平分別下調了72.53％和78.68％。(2)體內基因治療時,與

9、對照組比,8314/anti-hEGFR pDNA/PILP處理組,8314/anti-hEGFRpDNA/PILP處理組和聯合治療組的腫瘤生長抑制率分別為36.32％,46.13％和74.04％。統計學結果表明:與對照組比,anti-hEGFR pDNA組,8314/anti-hEGFRpDNA/PILP處理組和聯合治療組對腫瘤生長有抑制作用且兩單基因治療組與聯合治療組間差異顯著(P<0.05),其余各組之間無顯著性差異(P>0.05

10、)。荷瘤鼠生存時間在單基因治療組與聯合治療組間的差別異有非常顯著性意義(P=0.002)。其余各組之間無差異(P=0.707)。8314/anti-hEGFR pDNA/PILP處理組和聯合治療組可將hEGFR基因表達下調66.71％和89.01％,將hEGFR蛋白水平分別降低56.72％和80.73％。
　　 結論：體內外實驗表明,靶向hEGFR mRNA和hTERT mRNA的小干擾聯合基因治療較單基因治療的抑瘤作用更顯著,

11、兩者聯合運用可產生顯著增強效應。
　　 第三章 PILP介導的肝特異性shRNA-hTERT治療實驗性人肝癌的實驗
　　 目的:構建肝特異性啟動子載脂蛋白A-I(ApoAI)啟動的靶向hTERTmRNA的治療質粒,結合免疫脂質復合物(PILP)技術,實現有效和肝特異性的基因治療,以減小非靶向性基因表達可能產生的副作用。
　　 方法：用ApoAI啟動子分別替換增強型綠色熒光蛋白(EGFP)表達質粒pCMV-EGFP

12、中的CMV啟動子和靶向hTERT mRNA的治療質粒PU6-shTERT(編碼靶向hTERT mRNA內的1031-1059核苷酸序列的小發(fā)夾RNA)中的U6啟動子,構建出質粒pApoAI-EGFP和pApoAI-shTERT。用ExGen500體外轉染試劑將質粒分別瞬時轉染HepG2,SMMC-7721,Lo2,MCF7,TF-1a,ACC-2和IMR90細胞:48 h后,熒光顯微鏡下觀察EGFP的表達,72h后,測各處理組細胞的端粒

13、酶活性。將質粒ApoAI-EGFP,CMV-EGFP,ApoAI-shTERT和U6-shEGFP分別制備成PILP,PILP通過受體特異性單克隆抗體(MAb),小鼠83-14 Mab對人胰島素受體或大鼠8D3 MAb對小鼠轉鐵蛋白受體,靶向肝癌。將2000,000個肝癌SMMC-7721細胞種于裸鼠背部皮下后,從第10天開始,每5天靜脈注射PILP進行小干擾基因治療。
　　 結果：體外表達實驗表明,轉染pCMV-EGFP可導致

14、EGFP在所有細胞中表達,而轉染pApoAI-EGFP后,EGFP的表達僅出現在肝源性細胞中,包括HepG2,SMMC-7721細胞和正常肝細胞Lo2。pU6-shTERT處理可抑制所有端粒酶陽性的癌細胞的生長和端粒酶活性。pApoAI-shTERT。處理僅抑制端粒酶陽性的肝癌細胞的生長和端粒酶活性,對無端粒酶活性的正常肝細胞無抑制作用。荷H22瘤的小鼠體內基因表達實驗表明:用pCMV-EGFP處理的小鼠,EGFP在其肝,腫瘤,腦和肺中