缺氧誘導因子1α的RNAi表達載體構建及其在前列腺癌細胞PC-3研究中的作用.pdf

1、目的：構建HIF-1α(缺氧誘導因子1α)的RNAi系統(tǒng)表達載體并研究其在前列腺癌細胞PC-3中的作用。
　　 方法：根據GenBank中HIF-1α序列信息，化學合成靶向HIF-1α基因的寡核苷酸鏈，退火、克隆到經雙酶切的pSUPER.retro.puro載體上，轉化DH5α菌株，提取質粒，進行限制性內切酶酶切鑒定和測序分析；將重組質粒轉染前列腺癌PC-3細胞，評價轉染效率；質粒轉染48h后收集細胞，檢測前列腺癌PC-3細胞內

2、HIF-1α mRNA及其蛋白的表達情況；利用其puro抗藥性對轉染細胞進行篩選，觀察克隆生成情況；將單克隆擴大培養(yǎng)2周后收集細胞株，檢測pSUPER-siHIF-1α/PC-3細胞株中HIF-1α蛋白的表達情況。
　　 結果：重組質粒經雙酶切電泳及序列分析證實，目的片段成功插入到設計位點，并且序列完全一致，表明HIF-1α的RNAi表達載體的構建成功；重組質粒與GFP質粒共轉染前列腺癌PC-3細胞36h后轉染效率為(87.15

3、±2.36)％；該質粒可顯著降低前列腺癌PC-3細胞HIF-1α mRNA及其蛋白的表達，抑制效率分別為75.2％、72.8％(P＜0.05)加藥篩選2周可觀察到單克隆生成；pSUPER-siHIF-1α/PC-3細胞株中HIF-1α蛋白表達亦顯著降低，抑制效率為83.
　　 結論：利用RNAi技術可成功構建抑制前列腺癌HIF-1α表達的siRNA重組表達載體，為研究HIF-1α在前列腺癌發(fā)病機理及增殖、轉移中的功能奠定了基礎，