IL-10對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的Ana-1細(xì)胞MyD88-核因子κB通路的抑制作用及其機(jī)制探討.pdf

1、研究背景和目的：
　　 炎癥反應(yīng)是機(jī)體抵抗病原微生物感染的重要防御機(jī)制。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中,炎癥細(xì)胞激活、炎癥介質(zhì)與補(bǔ)體成份釋放。雖然強(qiáng)大的炎癥反應(yīng)能更有效地殺滅病原微生物,但炎癥細(xì)胞過(guò)度活化及相關(guān)細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放,會(huì)損傷自身組織的結(jié)構(gòu)細(xì)胞,出現(xiàn)相應(yīng)器官功能衰竭,最終在整體水平上誘發(fā)多器官功能受損。肺部嚴(yán)重感染時(shí)易誘發(fā)急性肺損傷(Acute Lung Injury,ALI),ALI也往往是多器官功能不全綜合征(Mult

2、iple Organ Dysfunction Syndrome,MODS)中最先出現(xiàn)的器官功能障礙,在MODS的整個(gè)發(fā)病過(guò)程中居重要甚至是決定性的地位。目前研究顯示,ALI與機(jī)體防御機(jī)制過(guò)度激活,促炎/抑炎反應(yīng)失衡,過(guò)度氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)損傷組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞密切相關(guān)。因此,在有效的抗感染基礎(chǔ)上,重建促炎/抑炎反應(yīng)平衡,協(xié)調(diào)炎癥細(xì)胞因子的釋放,阻斷炎性介質(zhì)的瀑布反應(yīng)是ALI早期治療的關(guān)鍵。
　　 白細(xì)胞介素-10(Interleuki

3、n-10,IL-10)是體內(nèi)抑炎細(xì)胞因子之一,由Th2細(xì)胞、人CD4+和CD8+的T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞等細(xì)胞分泌。IL-10作為一個(gè)以免疫抑制為主的多向免疫調(diào)節(jié)因子,在重建促炎/抑炎反應(yīng)平衡中有重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)肺炎克雷伯桿菌大鼠重癥肺炎模型的研究表明,小劑量糖皮質(zhì)激素能抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng),減輕肺組織病理?yè)p傷,改善動(dòng)脈血氧分壓,同時(shí)血清IL-10表達(dá)上調(diào),提示IL-10與調(diào)節(jié)過(guò)度炎癥反應(yīng)有關(guān)[1-2]。作為一種炎癥

4、反應(yīng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子,IL-10外源性補(bǔ)充能降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[3]。目前認(rèn)為,IL-10可能通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄,影響炎癥細(xì)胞因子mRNA的穩(wěn)定性,下調(diào)炎癥細(xì)胞因子血漿濃度等機(jī)制下調(diào)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度[4],而且還可能與抑制單核細(xì)胞粘附、激活其他抑炎細(xì)胞因子合成與釋放、拮抗炎性介質(zhì)等有關(guān),但具體的機(jī)制尚未完全闡明。
　　 髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是將Tol

5、l樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)識(shí)別的LPS炎癥信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi)的分子。在MyD88基因敲除鼠中,LPS刺激并不能使血清中TNF-α、IL-1、IL-6生產(chǎn)增加,提示MyD88在LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的信號(hào)通路上起關(guān)鍵作用[5]。當(dāng)TLR4識(shí)別LPS后,其TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象改變,招募存在于胞漿內(nèi)的也含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白分子,此接頭蛋白分子家族中第一個(gè)被鑒定的是MyD88。TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生同

6、源或異源二聚體化并與MyD88的Toll結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合體,同時(shí)誘導(dǎo)My D88死亡結(jié)構(gòu)域活化,而形成TIR-MyD88活性復(fù)合體。TIR-MyD88活性復(fù)合體相繼激活I(lǐng)RAK、TRAF6、IKK,引起I-κB降解與核因子κB(Nuclcar factorkappa B,NF-κB)活化。NF-κB是廣泛存在于胞漿中的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)NF-κB活化后,其p65亞基從胞漿向胞核移位,與多種基因的啟動(dòng)子序列κB位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)和調(diào)控炎癥介

7、質(zhì)的表達(dá)。已有實(shí)驗(yàn)證明阻斷p65亞基的表達(dá)可以有效降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞上清中TNF-α含量[6]。由此可見,TLR4/MyD88/NF-κB是細(xì)胞對(duì)LPS刺激產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的一條重要通路。已有研究證明IL-10能抑制IκB激酶(IKK)的活性,從而抑制NF-κB活化[7]。也有研究證明IL-10對(duì)NF-κB的作用可能不僅僅局限在IKK及其下游的水平上,而在上游也會(huì)造成影響[8]。我們推測(cè)IL-10可能作用于TLR4/MyD88/NF-κB

8、通路中MyD88節(jié)點(diǎn),從而影響其下游的NF-κB活性來(lái)下調(diào)炎癥反應(yīng)。
　　 鑒此,我們?cè)隗w外以LPS啟動(dòng)小鼠巨噬細(xì)胞株(Ana-1)炎癥反應(yīng),采用RT-PCR、Western blot等方法觀察IL-10預(yù)處理對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MyD88表達(dá)、NT-κB活化的影響；通過(guò)蛋白酶體抑制劑Epoxomicin中斷蛋白酶體對(duì)MyD88的降解,Western blot等方法檢測(cè)MyD88表達(dá),進(jìn)一步探討IL-10通過(guò)MyD88下調(diào)炎癥

9、反應(yīng)中的機(jī)制。
　　 方法
　　 1、小鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小鼠巨噬細(xì)胞株Ana-1細(xì)胞用高糖的RPMI-1640培養(yǎng)基加10％小牛血清進(jìn)行培養(yǎng),直接吸管吹打傳代,選用處于指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞六孔板種板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、細(xì)胞分組與處理
　　 2.1已種板的Ana-1細(xì)胞分為L(zhǎng)PS組與IL-10+LPS組。IL-10+LPS組細(xì)胞在LPS處理前加入IL-10(15ng/ml)預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)后,兩

10、組細(xì)胞同時(shí)予LPS(50ng/ml)刺激,于0、0.5、1、2小時(shí)收集培養(yǎng)上清與細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)ELISA方法檢測(cè)兩組細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量,提取總RNA,RT-PCR檢測(cè)MyD88 mRNA含量。分別提取總蛋白及胞漿、胞核蛋白,Western blot法檢測(cè)MyD88蛋白表達(dá)、胞漿、胞核NT-κB p65亞基的含量。
　　 2.2為探討IL-10對(duì)MyD88的作用機(jī)制,Ana-1細(xì)胞分為空白組、LPS組、IL-10+L

11、PS組、IL-10+LPS+低濃度Epoxomicin(100nM)處理組、IL-10++LPS+高濃度Epoxomicin(1000nM)處理組。在LPS處理后2h收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞MyD88蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論
　　 本研究發(fā)現(xiàn):
　　 1、LPS刺激使MyD88/NF-κB通路活化,促進(jìn)炎癥因子TNF-α表達(dá)；
　　 2、IL-10不影響細(xì)胞內(nèi)MyD88基因