芪蛭皺肺顆粒對LPS誘導致炎肺泡Ⅱ型上皮細胞的增殖和生物學活性的影響.pdf

1、目的：探究新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar typeⅡepithelial cell, AT-Ⅱ)的原代培養(yǎng)方法。通過脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)制造細胞炎癥模型,芪蛭皺肺顆粒給藥干預,觀察其對致炎 AT-Ⅱ細胞形態(tài)學、生長周期、線粒體活性、肺泡表面活性蛋白A(SP-A)的影響。以探察其防治慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的作用機

2、制,同時為開發(fā)研究芪蛭皺肺顆粒提供藥效學基礎。
　　方法：取SPF級新生Wistar大鼠肺臟,采用胰蛋白酶聯(lián)合膠原酶消化法分離 AT-Ⅱ細胞,免疫黏附結(jié)合反復貼壁法純化細胞,體外培養(yǎng)細胞,透射電鏡鑒定細胞。細胞造模方法:10組生長狀態(tài)及數(shù)目接近的細胞,2組不加 LPS,2組加5ug/ml的 LPS,2組加10ug/ml的 LPS,2組加20ug/ml的 LPS,2組加40ug/ml的 LPS,干預1天。第二天,向用5種濃度 LPS

3、干預過的細胞其中一組加入100ug/ml的芪蛭皺肺顆粒,干預2天,同濃度的另一組作對照。觀察并檢測各組AT-Ⅱ細胞的形態(tài)學改變,板層小體、線粒體和生長周期的變化,以及 SP-A的表達。
　　結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的 AT-Ⅱ細胞生長狀態(tài)良好。(2)電鏡下觀察到板層小體。LPS組板層小體數(shù)目減少,芪蛭皺肺顆粒干預組其數(shù)目有所增加。(3) MTT顯示,LPS組 AT-Ⅱ細胞出現(xiàn)異常增殖情況,且其增殖率隨 LPS濃度的升高而加強。芪蛭皺肺

4、顆粒干預后,細胞增殖受到了抑制,增殖率有所下降。(4)細胞周期檢測結(jié)果顯示,LPS組 AT-Ⅱ細胞的細胞周期處于 G2期和 S期的百分比較高。其增殖百分比隨著 LPS濃度的升高而上升。芪蛭皺肺顆粒干預后,G2期和 S期的百分比有所下降。(5)激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體羅丹明123染色結(jié)果顯示,空白組細胞的線粒體活性強,熒光亮度高。LPS組隨著其濃度的升高,熒光強度逐漸減弱。加入芪蛭皺肺顆粒干預后,熒光強度有所恢復。(6)SABC免疫組化

5、法檢測 SP-A顯示:①DAB顯色:空白組的 AT-Ⅱ細胞質(zhì)內(nèi)可以觀察到較多的棕黃色顆粒?？瞻准榆悟伟櫡晤w粒組細胞內(nèi)可見較空白組更多的棕黃色顆粒,顏色較深。而 LPS組細胞內(nèi)棕黃色顆粒明顯減少,且 LPS濃度越高,其棕黃色顆粒越少、顏色越淺。芪蛭皺肺顆粒干預組的細胞內(nèi),棕色顆粒較之同濃度LPS誘導組有所增加,且顏色有一定加深。②FITC熒光染色:空白組的 AT-Ⅱ細胞熒光較強?？瞻准榆悟伟櫡晤w粒組細胞熒光強度較空白組更大。而LPS組細胞

6、熒光強度減弱,且隨著 LPS濃度的增高,熒光越來越淡,芪蛭皺肺顆粒干預組細胞的熒光強度較之同濃度 LPS誘導組有所增加。
　　結(jié)論：本次實驗提取的原代 AT-Ⅱ細胞符合體外實驗要求,第24~72 h內(nèi)處于最佳生長狀態(tài),是進行實驗研究的理想時間段。LPS可以促使 AT-Ⅱ細胞產(chǎn)生炎癥反應而異常增殖,并減弱 AT-Ⅱ細胞的 SP-A表達,降低該細胞的生物學活性。芪蛭皺肺顆粒對 LPS誘導致炎肺泡Ⅱ型上皮細胞的異常增殖有抑制作用,可改善