RNAi沉默MMP-2基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞增殖影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　食管癌是有中國(guó)特色的惡性腫瘤之一。在中國(guó)的太行山區(qū)，食管癌的發(fā)病率居世界首位。雖然近年來(lái)手術(shù)及放、化療等綜合治療方法取得較大的發(fā)展，但是食管癌總的遠(yuǎn)期生存率并沒(méi)有明顯改善，腫瘤局部侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是死亡的主要原因。腫瘤的發(fā)展過(guò)程是一個(gè)多階段、涉及多個(gè)基因參與的復(fù)雜過(guò)程，MMP-2被認(rèn)為在多種惡性腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究通過(guò)構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體介導(dǎo)siRNA沉默MMP-2基因，觀察其對(duì)人食管癌KYSE15

2、0裸小鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用，為食管癌的基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1建立靶向MMP-2基因的shRNA慢病毒載體
　　設(shè)計(jì)3個(gè)靶向MMP-2基因的siRNA序列，經(jīng)Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢索，確認(rèn)設(shè)計(jì)的siRNA序列無(wú)其它同源序列。對(duì)應(yīng)siRNA序列設(shè)計(jì)3個(gè)shRNA對(duì)應(yīng)的DNA序列。siRNA正義鏈和反義鏈之間以loop連接。構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序鑒定后用慢病毒包裝。將慢病毒轉(zhuǎn)染目標(biāo)

3、細(xì)胞KYSE150后采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)干擾效果。根據(jù)干擾效果篩選干擾效果最佳的序列進(jìn)行慢病毒的大量包裝，純化后用于下一步裸鼠移植瘤的實(shí)驗(yàn)。
　　2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
　　噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)目和增殖、生長(zhǎng)能力。
　　3裸鼠成瘤預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　收集食管癌KYSE150細(xì)胞5×106個(gè)，用PBS稀釋至0.1ml，于裸鼠右側(cè)脅肋部皮下注射，構(gòu)建人食管癌異種移植瘤模型。
　　4抑制MMP-2表達(dá)對(duì)人食管癌癌細(xì)

4、胞系KYSE150影響的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　24只裸鼠隨機(jī)分為3組，每組8只。將含有干擾MMP-2基因片段的慢病毒及含有無(wú)關(guān)序列片段的慢病毒分別轉(zhuǎn)染食管癌KYSE150細(xì)胞，轉(zhuǎn)染成功后將MMP-2 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染的KYSE150細(xì)胞(實(shí)驗(yàn)組)、無(wú)關(guān)序列慢病毒轉(zhuǎn)染的KYSE150細(xì)胞(陰性對(duì)照組)及未轉(zhuǎn)染任何載體的KYSE150細(xì)胞(空白對(duì)照組)分別接種至裸鼠右側(cè)脅肋部皮下。觀察移植瘤的生長(zhǎng)情況，腫瘤體積按公式計(jì)算，體積=1/2×長(zhǎng)

5、徑×短徑2。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始30天后處死裸鼠，分離皮下移植瘤計(jì)算腫瘤體積和重量。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了3個(gè)靶向MMP-2基因的RNA干擾慢病毒載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.在目的細(xì)胞中篩選有效干擾序列，RT-PCR顯示3個(gè)shRNA干擾序列對(duì)MMP-2mRNA抑制效果分別為：40.5％，41.4％，78.9％，和空白對(duì)照及陰性對(duì)照組相比MMP-2 mRNA水平明顯受到抑制(p<0.05)；western blo

6、tting顯示3個(gè)質(zhì)粒干擾后MMP-2/β-actin吸光度比值分別為：0.187±0.072，0.261±0.095，0.063±0.016，和空白對(duì)照及陰性對(duì)照組比較MMP-2蛋白水平明顯受到抑制(p<0.05)，經(jīng)篩選shRNA-3為最有效的干擾序列。
　　3.逐孔稀釋滴度測(cè)定法測(cè)定病毒滴度，病毒滴度為4.26×108 TU/ml。
　　4.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的MMP-2基因沉默組細(xì)胞增殖能力顯著低于空白對(duì)照和

7、陰性對(duì)照組(p<0.001)。
　　5.成功建立了裸鼠食管癌細(xì)胞系移植瘤模型。和陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較，RNA干擾組的腫瘤生長(zhǎng)明顯緩慢，腫瘤體積和重量明顯縮小和減輕(p<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、RNA干擾的方法可以高效地沉默食管癌細(xì)胞KYSE150 MMP-2基因的表達(dá)，可作為一種基因敲除、基因治療研究的理想手段。
　　2、針對(duì)MMP-2基因設(shè)計(jì)的表達(dá)shRNA的慢病毒載體能在體外狀態(tài)下從mRNA和

8、蛋白水平特異、高效地抑制人食管癌細(xì)胞系KYSE150中MMP-2基因的表達(dá)，證明慢病毒是一種有效的RNAi傳遞載體。
　　3、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示靶向MMP-2的慢病毒載體轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系KYSE150后，引起其生長(zhǎng)增殖速度明顯減慢。
　　4、沉默食管癌細(xì)胞中MMP-2基因的表達(dá)能有效抑制人食管癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)外首次在活體條件下驗(yàn)證了MMP-2基因?qū)κ彻馨┘?xì)胞的生物學(xué)行為的影響。為下一步研究奠定了基礎(chǔ)，MMP-2有望成為