CD86是NK細胞的激活性受體.pdf

1、天然殺傷細胞(NK細胞)是天然免疫系統(tǒng)中非常重要的一類細胞毒性淋巴細胞，它是免疫系統(tǒng)中的第一道防線。NK細胞是一群特殊的細胞，它不同于獲得性免疫在發(fā)揮功能的時候是需要抗體和主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的。在哺乳類動物受到病毒感染或者腫瘤侵襲的時候，NK細胞會非常迅速地產(chǎn)生反應(yīng)。NK細胞的活化是由激活性受體和抑制性受體之間的平衡所決定的，如果激活信號占主導(dǎo)地位NK細胞就會被活化，反過來如果抑制信號占主導(dǎo)那么NK細胞將受到抑制。NKG2D

2、和NKp44是與殺傷腫瘤密切相關(guān)的NK細胞的激活性受體成員。在NK細胞的胞漿里有很多溶細胞顆粒，當(dāng)NK細胞活化時，它們會釋放到細胞與細胞的接觸面。這些顆粒包括溶細胞的蛋白，比如穿孔素(perforin)和顆粒酶（granzyme），它們在促使靶細胞的死亡的過程中發(fā)揮重要作用。CD107a又叫做LAMP-1是一種溶酶體相關(guān)的膜蛋白，屬于糖蛋白類，當(dāng)NK細胞脫顆粒時，原來處于管腔膜的CD107a將暴露在細胞表面的突觸上。Alter等發(fā)現(xiàn)當(dāng)N

3、K細胞被靶細胞刺激的時候CD107a也會在其細胞表面檢測到，因此作為NK發(fā)揮殺傷作用時候脫顆粒的標(biāo)志物。
　　細胞毒T淋巴細胞相關(guān)抗原4(CTLA4)是表達在激活的T細胞表面而作負調(diào)節(jié)其活性的一種抗原。而CTLA4Ig是由人CTLA4胞外區(qū)和人IgG1的重鏈恒定區(qū)組成的融合蛋白。它通過競爭性結(jié)合抗原遞呈細胞(APC)上的CD80、CD86分子來阻礙T細胞上的CD28同CD80、CD86結(jié)合給T細胞傳遞共刺激信號，從而成功誘導(dǎo)T細胞

4、的耐受。很多對CTLA4Ig的體外和體內(nèi)的研究表明其能夠治療自身免疫性疾病和控制器官排斥反應(yīng)。CTLA4Ig的商業(yè)化產(chǎn)品Abatacept和Balatacept已被美國FDA批準(zhǔn)治療諸如關(guān)節(jié)炎之類的自身免疫性疾病，同時還可以用于控制移植排斥反應(yīng)。
　　但是，在使用了CTLA4Ig治療的病人中，他們的腫瘤發(fā)生率和感染率并沒有如預(yù)期的顯著升高，這一點引起了我們的關(guān)注。為什么當(dāng)CTLA4Ig作用于T細胞，使其活性受到抑制時，抗腫瘤和抗感

5、染的免疫能力依然維持而沒有減弱？同時，已被大家公認，在對腫瘤的監(jiān)視和抗感染中，獲得性免疫和天然免疫系統(tǒng)同時發(fā)揮著作用，那么是否在這個過程中，當(dāng)獲得性免疫被抑制的同時天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮了作用呢？這一點還有待驗證。Grohmann等人發(fā)現(xiàn)CTLA4Ig能夠通過APC表面的B7分子影響APC的功能。與此同時，有研究證實靜息的NK細胞可以表達CD86分子，而當(dāng)NK細胞被激活時，可以同時表達能夠被CTL4Ig結(jié)合的CD80和CD86分子。這些前人的

6、研究結(jié)果促使我們對探索CTLA4Ig是否能通過調(diào)節(jié)NK細胞的功能從而在機體的免疫調(diào)節(jié)中起到作用產(chǎn)生了興趣。
　　在我們的研究中，體內(nèi)和體外實驗數(shù)據(jù)表明CTLA4Ig能夠通過激活NK細胞增強其殺傷靶細胞的能力，同時，也提出了在殺傷靶細胞的過程中可能存在的新的分子機制。我們研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)論總結(jié)如下:
　　一.體內(nèi)試驗中CTLA4Ig減少了黑色素瘤B16F0的轉(zhuǎn)移和延長了荷瘤小鼠的存活時間:
　　為了研究CTLA4Ig在

7、腫瘤免疫中的作用，我們采用性別和年齡匹配的B6小鼠作為研究對象。在第0天尾靜脈接種B16F0細胞，然后分別在第0天、第3天和第6天尾靜脈注射CTLA4Ig和對照IgG。以小鼠的生存曲線和其肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)量為觀察指標(biāo)。結(jié)果表明，CTLA4Ig實驗組小鼠的生存時間明顯長于對照組，CTLA4Ig實驗組小鼠肺部腫瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)量也明顯少于對照組。
　　二.體內(nèi)實驗中CTLA4Ig增強小鼠NK細胞的毒性:
　　1.CTLA4Ig通過作用

8、于NK細胞來減少SCID小鼠體內(nèi)黑色素瘤的轉(zhuǎn)移;
　　已經(jīng)被證實CTLA4Ig是通過結(jié)合B7分子從而產(chǎn)生對獲得性免疫中T細胞的調(diào)節(jié)，文獻和我們的實驗表明NK細胞中也表達B7分子，我們假設(shè)CTLA4Ig可能會對NK細胞產(chǎn)生調(diào)節(jié)，而NK細胞又是腫瘤細胞的強有力的效應(yīng)細胞，我們采用SCID小鼠和B6小鼠作為研究對象。實驗結(jié)果表明，CTLA4Ig處理的SCID荷瘤小鼠能夠有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移;根據(jù)以上實驗的提示，NK細胞可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中起到

9、了非常重要的作用。因此，為了進一步明確可能存在這種作用，我們又用PK136清除B6小鼠體內(nèi)的NK細胞，結(jié)果顯示CTLA4Ig處理組和對照組腫瘤的轉(zhuǎn)移數(shù)量沒有明顯差異，這又證明了CTLA4Ig是通過增強NK細胞的毒性來抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　2.CTLA4Ig增強了腫瘤侵潤區(qū)域NK細胞的毒性;
　　為了檢測在CTLA4Ig作用后NK細胞的細胞毒性的變化，在我們的實驗研究中，腫瘤接種后第10天處死小鼠，分離小鼠肺臟的淋巴細胞，采

10、用磁珠分選技術(shù)純化NK細胞，測試其毒性分子的表達和殺傷靶細胞能力的強弱。結(jié)果顯示，CTLA4Ig組腫瘤侵潤部位的NK細胞毒性明顯高于IgG對照組的NK細胞毒性，因此提示CTLA4Ig能夠增強NK細胞的毒性來減少腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　3.CTLA4Ig能夠提高腫瘤侵潤部位NK細胞的CD107a和perforin的表達;
　　因為NK細胞脫顆粒的標(biāo)志物CD107a和效應(yīng)分子穿孔素是NK細胞毒性的兩個重要指標(biāo)。因此，檢測了腫瘤侵潤部位

11、NK細胞CD107a和perforin的表達，結(jié)果顯示CTLA4Ig處理組其CD107a和perforin的表達明顯高于對照組。這提示腫瘤侵潤部位的NK細胞可以被CTLA4Ig激活從而顯著提高其殺傷靶細胞的能力。
　　三、體外實驗中CTLA4Ig能夠提高NK細胞毒性對靶細胞的殺傷;
　　1.在體外CTLA4Ig能夠提高小鼠脾臟NK細胞毒性對靶細胞的殺傷;
　　為了在體外驗證CTLA4Ig對NK細胞毒性的作用，我們先分離

12、B6小鼠脾臟的NK細胞，然后用磁珠分選技術(shù)純化NK細胞，隨后分別和加入了CTLA4Ig與對照IgG的YAC-1細胞共培養(yǎng)，然后檢測NK細胞對YAC-1細胞的殺傷。實驗結(jié)果顯示CTLA4Ig實驗組的NK細胞殺傷YAC-1細胞的能力比對照組明顯增強。
　　2.在體外CTLA4Ig能夠提高荷瘤小鼠腫瘤侵潤部位NK細胞的毒性;
　　實驗中取出B6荷瘤小鼠的肺臟，隨后用磁珠分選技術(shù)純化分離肺臟腫瘤侵潤的NK細胞，然后按設(shè)定比例與YAC

13、-1腫瘤細胞共培養(yǎng)，檢測NK細胞對YAC-1的殺傷作用，通過實驗組CTLA4Ig和對照組IgG的NK細胞殺傷作用的比較，結(jié)果顯示CTLA4Ig能夠顯著提高荷瘤小鼠腫瘤侵潤部位NK細胞的細胞毒性。
　　3.在體外CTLA4Ig能夠提高人外周血NK細胞的細胞毒性:
　　通過分離人外周血單個核細胞(PBMC)，用磁珠分選技術(shù)純化其NK細胞，然按設(shè)定比例與K562腫瘤細胞共培養(yǎng)，最后檢測NK細胞對K562的殺傷作用。通過比較實驗組C

14、TLA4Ig和對照組IgG中NK細胞對靶細胞的殺傷，結(jié)果顯示CTLA4Ig能夠顯著提高人外周血NK細胞的細胞毒性。
　　4.在體外CTLA4Ig能夠顯著提高NK92MI細胞的細胞毒性;
　　因為通過磁珠分選的方法分離出來的NK細胞并沒有達到絕對純化，其他細胞可能會干擾實驗的結(jié)果，因此我們采用了人NK92MI這種NK細胞系，來進一步觀察CTLA4Ig對NK細胞毒性的影響。同時，NK92MI細胞上幾乎不表達CD16這種，所以可以

15、進一步排除CTLA4Ig中Fc段可能帶來的ADCC作用的干擾。實驗中，將NK92MI細胞與靶細胞K562共培養(yǎng)，通過檢測實驗組CTLA4Ig和對照組IgG處理的NK92MI細胞對K562細胞的殺傷作用，結(jié)果顯示CTLA4Ig能夠顯著提高NK92MI的細胞毒性。
　　四、CD86分子是CTLA4Ig介導(dǎo)的NK細胞毒性增強的激活性受體;
　　1.NK細胞上CD86分子的表達能夠在靶細胞和細胞因子刺激的環(huán)境中顯著提高;
　　

16、根據(jù)文獻報道，CTLA4Ig能夠高親和力的結(jié)合CD80和CD86分子，我們猜想CTLA4Ig可能是通過與它們結(jié)合起到增強NK細胞的功能從而殺傷腫瘤細胞的。為了進一步明確NK細胞表面有CD80和CD86的表達，我們檢測了在正常生理條件下它們的表達，流式結(jié)果提示在小鼠脾臟NK細胞中大約有6％的CD86的表達，但是沒有CD80的表達;在體外與YAC-1共培養(yǎng)或者IL-15刺激下的NK細胞CD86的表達有顯著提高。另外，我們檢測了在荷瘤小鼠B1

17、6腫瘤侵潤部位的NK細胞表面CD80和CD86的表達，結(jié)果提示黑色素瘤B16細胞能夠顯著提高CD86分子的表達，CD80的表達卻沒有明顯提高。以上結(jié)果提示在腫瘤環(huán)境中NK細胞能夠顯著提高其表面CD86的表達。
　　2.CTLA4Ig能夠顯著提高NK細胞激活性受體NKG2D和NKp44的表達水平;
　　總所周知，NK細胞的殺傷功能與其表面的激活性受體有密切的聯(lián)系，同時NK細胞在殺傷靶細胞的過程中的一條途徑是ADCC作用。為了排

18、除CTLA4Ig可能介導(dǎo)的ADCC作用，同時為了驗證CD86在NK細胞中的作用，我們采用了NK92MI這種能夠自身高表達CD86分子的細胞系作為效應(yīng)細胞，但同時其表面無CD32、CD64的表達，而只有少量CD16這種低親力FcR的表達。在體外實驗的結(jié)果提示，CTLA4Ig能夠顯著提高NK92MI細胞的激活性受體NKG2D和NKp44的表達水平。
　　3.CD86可能在增強NK細胞對靶細胞的殺傷作用里起到類似激活性受體的作用;

19、>　　為了排除抗CD80抗體和抗CD86抗體這兩種封閉性抗體對NK細胞毒性的影響，我們將抗CD80抗體和抗CD86抗體分別加入到NK92MI培養(yǎng)體系中，然后檢測NK細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)沒有顯著變化。然后，我們用抗CD86抗體和CTLA4Ig進行競爭實驗。結(jié)果顯示，當(dāng)我們把抗CD86封閉抗體和CTLA4Ig同時加入到NK92MI和K562腫瘤細胞的共培養(yǎng)體系中，然后檢測NK92MI細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，發(fā)現(xiàn)其殺傷作用與對照組

20、有部分減弱;當(dāng)我們把抗CD86封閉抗體提前CTLA4Ig2小時加入NK92MI和K562腫瘤細胞的共培養(yǎng)體系中，目的先讓抗CD86封閉抗體先占據(jù)CD86分子結(jié)合位點，然后檢測其對腫瘤細胞的殺傷時，我們發(fā)現(xiàn)由CTLA4Ig產(chǎn)生使NK細胞毒性增強的作用被逆轉(zhuǎn)了。這些結(jié)果提示，CD86可能在CTLA4Ig增強NK細胞抗腫瘤毒性的過程中起到關(guān)鍵作用。
　　總結(jié):我們驗證了CTLA4Ig能夠顯著減少B16腫瘤的轉(zhuǎn)移以及延長荷瘤小鼠的生存時間

21、;同時觀察到在清除了NK細胞的小鼠注射CTLA4Ig后，并沒有改善腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移;在體內(nèi)CTLA4Ig作用后能夠顯著提高NK細胞毒性相關(guān)的CD107a和perforin的表達。另外，我們在體內(nèi)外實驗中驗證了在腫瘤環(huán)境的刺激下，NK細胞能夠提高CD86分子的表達;高表達CD86分子的人NK細胞系，體外實驗在CTLA4Ig的作用下能明顯增強其殺傷靶細胞的能力。最后我們用抗體封閉實驗，驗證了CTLA4Ig可能是通過CD86分子起到使NK細胞毒