大鼠紋狀體內(nèi)注射LV-Shh促進(jìn)帕金森病模型大鼠神經(jīng)再生.pdf

1、背景:
　　 帕金森病(Parkinsondisease，PD)是由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergicneurons，DANs)進(jìn)行性丟失，導(dǎo)致紋狀體尾狀核-殼核多巴胺(dopamine，DA)支配喪失，引起靜止性震顫、肌強(qiáng)直和運(yùn)動(dòng)障礙等癥候群，其發(fā)病率逐年增高，目前臨床尚無特效療法。主要的藥物治療大多是暫時(shí)緩解癥狀。左旋多巴及多巴胺能受體激動(dòng)劑只能緩解疾病早期的運(yùn)動(dòng)障礙，長期服用可能會(huì)造成許多副作用，如左旋多巴誘導(dǎo)

2、的運(yùn)動(dòng)障礙，“開關(guān)”現(xiàn)象，幻覺，嗜睡等。此外，非藥物療法如深部腦刺激雖然可以改善患者的運(yùn)動(dòng)障礙和生活質(zhì)量，但具體的機(jī)制仍然不明確，且可能造成新的損傷。
　　 目前認(rèn)為，細(xì)胞替代療法(cellreplacementtherapy,CRT)可能是治療帕金森病的最佳途徑之一。它與以往傳統(tǒng)的以緩解癥狀為主的治療方法不同，細(xì)胞替代療法是建立在更全面認(rèn)識(shí)帕金森病的發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)上，以替代和修復(fù)變性和壞死的多巴胺能神經(jīng)元為目的的療法。而傳統(tǒng)的

3、外源性細(xì)胞替代療法是采用胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcells，ESCs)，神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstemcells，NSCs)或者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells，BMSCs)進(jìn)行移植，但研究表明這種移植方式尚面臨來源受限、移植后功能差、低存活率、安全性不確定、臨床可操作性差以及倫理學(xué)問題等，且移植后可致運(yùn)動(dòng)障礙，出現(xiàn)步態(tài)失調(diào)、跌倒、強(qiáng)直、甚至癡呆等非多巴胺能病

4、理特征，植入的DANs存活率低，其內(nèi)甚至出現(xiàn)Lewy小體。
　　 有鑒于此，本課題提出內(nèi)源性CRT設(shè)想:在外源性因素的刺激下，宿主內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞增殖、遷移至損傷部位并原位分化為局部細(xì)胞，最終在結(jié)構(gòu)和功能上恢復(fù)受損組織。在成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervoussystem，CNS)存在有兩個(gè)干細(xì)胞壁龕，分別是側(cè)腦室腦室下區(qū)(subventricularzone，SVZ)和海馬齒狀回(dentategyrus

5、，DG)。其內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞終生持續(xù)處于增殖狀態(tài)和神經(jīng)元替代現(xiàn)象，并沿一定路徑遷移。而且SVZ是成體神經(jīng)系統(tǒng)中最大的干細(xì)胞庫。因此，通過外源性的刺激營造SVZ內(nèi)的NSCs(SVZ-NSCs)增殖、遷移至黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)，分化為多巴胺能神經(jīng)元并原位與周圍的神經(jīng)元整合而產(chǎn)生有功能的內(nèi)環(huán)境，從而達(dá)到治療的效果，這可能是治療帕金森病的新思路。我們在文獻(xiàn)調(diào)研中發(fā)現(xiàn)，Sonichedgehog(SHH)為影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、發(fā)育乃至中腦多巴胺能神經(jīng)元形

6、成的眾多相關(guān)因子中最為關(guān)鍵的核心因子。
　　 SHH為Hedgehog家族成員之一，另外兩個(gè)家族成員分別是deserthedgehog(DHH)和Indianhedgehog(IHH)。SHH是涉及在胚胎發(fā)育中重要的分泌性多肽之一。它最初是由脊索和底板所分泌，在胚胎發(fā)育過程中調(diào)節(jié)多種組織器官的形成和發(fā)生。它是CNS模式、增殖和細(xì)胞命運(yùn)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵性信號(hào)分子。SHH信號(hào)為出生后和成體腦內(nèi)NSCs和神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵性機(jī)制，并維持終生。此

7、外，文獻(xiàn)也報(bào)道SHH具有促進(jìn)多種神經(jīng)元增殖、分化、促進(jìn)軸突生長和軸突導(dǎo)向以及神經(jīng)元的營養(yǎng)和保護(hù)等作用。其前體蛋白合成后自我催化裂解為分子量為19kD的N端片段(N-terminalproductofShh，SHH-N)，而SHH的功能區(qū)主要集中在N端，而非C端，且C端易造成整個(gè)蛋白肽鏈的斷裂。因此，本實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)集中在SHH-N。
　　 目的:
　　 本課題擬在克隆出目的基因Shh-N并將其構(gòu)建至慢病毒載體的基礎(chǔ)上，以

8、帕金森病大鼠為模型(立體定位注射6-羥基多巴(6-OHDA)損毀大鼠紋狀體），將包裝成功的病毒顆粒立體定位注射于大鼠紋狀體的損毀區(qū)域，檢測Shh在體過表達(dá)的情況，鑒定損毀區(qū)域神經(jīng)修復(fù)（殘存或新生神經(jīng)元/神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，黑質(zhì)-紋狀體通路）情況，結(jié)合行為學(xué)觀察，試圖證實(shí)內(nèi)源性治療PD的可行性，并探討其內(nèi)源性機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.Shh-N基因的克隆和載體構(gòu)建:從9天胎鼠的脊索組織中提取的總RNA，通過巢式逆轉(zhuǎn)錄聚合酶

9、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(nestedRT-PCR)克隆出目的基因Shh-N并純化，將其連接至慢病毒載體PCDH-MSC-T2A-copGFP-MSCV上構(gòu)建重組體PCDH-Shh-T2A-copGFP-MSCV(LV-Shh)。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法包裝生產(chǎn)慢病毒LV-Shh，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime-PCR)測定病毒滴度。
　　 2.帕金森病大鼠模型制作及實(shí)驗(yàn)分組:采用6-OHDA兩點(diǎn)注射損毀紋狀體的方法制作帕金森病的大鼠模型，根據(jù)不同

10、的處理分為以下4組:
　　 1)實(shí)驗(yàn)組(LV-Shh):于24小時(shí)后在大鼠紋狀體的同一坐標(biāo)點(diǎn)注射慢病毒LV-Shh
　　 2)空載體組(LV):于24小時(shí)后在大鼠紋狀體的同一坐標(biāo)點(diǎn)注射慢病毒LV
　　 3)假手術(shù)組（Sham）:假手術(shù)處理
　　 4)空白對(duì)照組(Blank):不做任何處理
　　 每組依次分為三個(gè)時(shí)間點(diǎn):2周(Ⅰ)，4周(Ⅱ)，8周(Ⅲ)。分別采用Westernblot和RT-PCR

11、的方法檢測Shh-N的表達(dá)情況。
　　 3.指標(biāo)檢測:在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死前7天，各組大鼠均進(jìn)行雙側(cè)紋狀體內(nèi)注射紅色熒光金(Fluro-ruby,FR)。在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)中的各組分別到達(dá)2周，4周，8周后，每組均采用頸背部正中皮下注射阿樸嗎啡的方法進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為的檢測。行為學(xué)檢測結(jié)束后進(jìn)行功能性檢測，采用免疫熒光，Westernblot和紅色熒光金示蹤相結(jié)合的方法觀察紋狀體內(nèi)注射LV-Shh對(duì)殘存的DNAs和新生的神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及

12、內(nèi)源性NSCs的影響。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用單因素的方差分析方法分析SHH-N在蛋白水平上各組過表達(dá)情況。采用析因分析方法分析紋狀體內(nèi)注射LV-Shh對(duì)PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為的恢復(fù)情況，F(xiàn)R示蹤的黑質(zhì)-紋狀體系統(tǒng)神經(jīng)軸突的改善情況以及紋狀體TH陽性的突觸和黑質(zhì)TH陽性的神經(jīng)元存活情況。同時(shí)采用單因素的方差分析方法分析8周各組蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建慢病毒的重組體PCDH-Shh-T2A-c

13、opGFP-MSCV;生產(chǎn)的慢病毒濃縮后測得的病毒滴度為:2×107IU/ml。
　　 2.Shh/SHH過表達(dá)情況:nestedRT-PCR結(jié)果顯示Shh在RNA水平上各時(shí)間點(diǎn)（2周、4周、8周）于各組均有表達(dá);Westernblot結(jié)果顯示在蛋白水平上于8周時(shí)的表達(dá)顯著高于2周、4周、空載體組、假手術(shù)組以及空白對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 3.紋狀體內(nèi)注射LV-Shh-N可以改善PD模型大鼠的行為:阿樸嗎啡誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)

14、行為實(shí)驗(yàn)中，與2周和4周進(jìn)行對(duì)比，8周的LV-Shh組的旋轉(zhuǎn)行為顯著改善(P＜0.01)。
　　 4.紋狀體內(nèi)注射LV-Shh-N可以恢復(fù)部分DNAs的功能:與2周和4周對(duì)比，8周的LV-Shh組紋狀體內(nèi)TH陽性的突觸和黑質(zhì)致密部TH陽性的神經(jīng)元顯著高于其他各組(P＜0.05)。
　　 5.紋狀體內(nèi)注射LV-Shh-N可以改善黑質(zhì)紋狀體投射系統(tǒng)的通路:紅色熒光金(fluoro-ruby,FR)示蹤神經(jīng)軸突的實(shí)驗(yàn)中，與2周

15、和4周進(jìn)行對(duì)比，8周的LV-Shh組紋狀體和黑質(zhì)致密部FR標(biāo)記的軸突的分布范圍和平均光密度較其他各組均有顯著提高(P＜0.05)。
　　 6.紋狀體內(nèi)注射LV-Shh-N可以誘導(dǎo)產(chǎn)生新生的NSCs和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞:與2周和4周進(jìn)行對(duì)比，8周的LV-Shh組紋狀體的損毀側(cè)出現(xiàn)GFAP抗原陽性，其他組均未見;且Westernblot結(jié)果顯示GFAP蛋白表達(dá)顯著高于8周時(shí)間點(diǎn)其他各組(P＜0.001);而在8周的LV組損毀側(cè)出現(xiàn)Nest