三種帕金森病模型大鼠的步態(tài)分析.pdf

1、目的:
　　在本實驗中，我們用CatWalk嚙齒類動物自動步態(tài)分析系統(tǒng)有效地評估了三種不同偏側PD大鼠模型的步態(tài)障礙表現(xiàn)。由于黑質紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經元的毀損是行為改變的直接原因，因此我們也在病理上評估了PD大鼠模型SNC與CPU的絡氨酸羥化酶蛋白表達(tyrosine hydroxylase，TH)并研究其與PD大鼠步態(tài)指標的相關關系。
　　方法:
　　1、實驗分組:
　　本實驗所用動物為SPF(Specifi

2、ed Pathogen Free)級的雄性SD大鼠(SpragueDawley rat)，每天每只予以飼料12～14g，飲水不限，控制體重290-310 g。實驗采用隨機分組方法，將實驗所用SPF級SD大鼠隨機分為3組，每組12只:CPU組、MFB組、SNC組。
　　2、CatWalk的數(shù)據(jù)采集:
　　所有實驗大鼠在正式CatWalk實驗前需進行適應性訓練，并在訓練合格后采集步態(tài)基線。
　　3、模型的制作和刺激電極的植

3、入:
　　所有大鼠經過腹腔注射戊巴比妥（40mg/Kg）麻醉后在手術臺上擺好俯臥位，連接并固定好立體定位儀。
　　4、獲取病理:
　　所有大鼠在接受最后一次CatWalk行為學檢測后予以灌注取腦組織進行病理切片。大鼠常規(guī)腹腔注射戊巴比妥(40mg/Kg)麻醉后在手術臺上擺好仰臥位。麻醉后將大鼠腹腔打開，往上從膈肌進入胸腔，膈肌剪開后快速充分暴露心臟，持14號鈍針頭從心尖部穿進左心室直至主動脈出口，剪開右心耳，快速灌注室

4、溫下0.9％生理鹽水，液體量約250ml/只。直至從右心耳流出清亮液體并肝臟顏色均勻變白后將灌注液換成冰凍4％多聚甲醛250ml，滴速先快后慢，總時間約30分鐘。內固定結束后將實驗大鼠頭部解剖取腦組織，并放入4％多聚甲醛溶液內室溫固定12小時，然后再放入25％蔗糖冰凍溶液中過夜充分脫水直至沉淀，以防止冰凍切片結晶過多。腦組織脫水沉淀后，將25％蔗糖溶液傾倒干凈，放入-20攝氏度冰箱內保存，或者直接取出腦組織用生理鹽水沖洗干凈后，根據(jù)大鼠

5、腦解剖定位圖譜切取并修整腦組織，切取范圍應該包括紋狀體和中腦部位，以進行下一步冰凍切片操作。將切取好的腦組織平整擺放在冰凍切片機組織支撐器上，周圍填滿包埋劑，放入冰凍切片機冰凍臺上固定，冰凍切片機溫度始終保持在-24攝氏度左右。將固定組織的支撐器夾緊于切片機上，調節(jié)進退按鈕使組織剛好輕微接觸刀片上，固定好刀片并調整放卷板，將切片厚度設置在20um，轉動切片機旋轉輪開始修整組織平面。修整好初始平面后開始正式切片，每隔三張切片保留2張，每隔

6、部位共15組30張切片，根據(jù)Paxinos andWatson的《大鼠腦立體定向圖譜》確定紋狀體(CPU)的部位在前囟前2.5mm～前囟后1.5mm，黑質致密部(SNc)的部位在前囟后4.5mm～6.3mm。通過圖譜尋找大致組織部位。將切好的冰凍切片放入-20攝氏度冰箱內保存，以備免疫組化染色所用。
　　5、免疫組化:
　　(1)取出保存好的冰凍切片恢復室溫30min后，用配好的PBS緩沖液滴于組織上，覆蓋完全后浸泡3分鐘后

7、倒掉PBS溶液再進行下一步清洗，切忌沖洗過度將組織沖離玻片。清洗時間及次數(shù)為3分鐘×3次;(2)清洗干凈后的組織用0.3％的Triton X-100破膜30分鐘，以便后續(xù)能與組織充分反應;(3)清洗干凈后的組織用3％H2O2去離子水浸泡8分鐘后，充分滅絕內源性過氧化物酶后繼續(xù)用PBS緩沖液清洗，清洗時間及次數(shù)亦為3分鐘×3次;(4)將配好的0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0)倒入小燒杯中，倒入量為能覆蓋玻片組織上2公分，放入

8、微波爐中加熱至沸騰后熄火取出，將經雙氧水處理后的玻片在燒杯表面預熱后放入其中，切勿直接放入，以免組織瞬間熱脹后脫片，緩慢放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(PH6.0)后放置5分鐘，再將燒杯重新放入微波爐中用小火加熱至即將沸騰后馬上熄火，取出后放置5分鐘后再次放入微波爐中加熱，如此仿佛加熱3次后取出靜置，直至恢復室溫后，用PBS緩沖溶液清洗，3分鐘×3次;(5)清洗完畢后山羊血清封閉液（含0.3％的TritonX-100）室溫孵育1

9、h，傾去表面多余血清;(6)封閉結束后用配好的1∶1000的TH一抗稀釋液（含0.3％的Triton X-100）在濕盒中放好并置于4℃冰箱內孵育過夜12小時，結束后從冰箱取出恢復室溫30分鐘，再用PBS緩沖液沖洗，3分鐘×3次;(9)滴加1∶200山羊抗小鼠IgG抗體-Fab段-HRP多聚體二抗（含0.3％的Triton X-100）并置入37℃的水浴恒溫箱中孵育30分鐘;取出后用PBS緩沖液清洗3分鐘×3次;(11) DAB顯色:滴

10、入DAB顯色劑，顯微鏡下觀察室溫顯色1～3min，PBS沖洗終止顯色，風干后用中性樹膠封片劑封片。
　　6、細胞計數(shù)與平均光密度分析:
　　應用DM4000B光學顯微鏡及拍照系統(tǒng)采集CPU及SNC所在平面照片。在IPP6.0圖像分析軟件下每隔6個層面計數(shù)SNC免疫反應陽性神經元的數(shù)目。即將制得的切片在40倍物鏡下計數(shù)的陽性神經元數(shù)目。應用IPP6.0圖像分析軟件從CPU四個冠狀層面(+1.2，0.8，0.00 and-0.4

11、mm)測量免疫反應陽性纖維的平均光密度(average optical density，AOD)。每只大鼠的不同層面所得測量值取平均值后進行統(tǒng)計學分析。將測得的AOD值與大腦皮層進行校對。將測得的SNC的神經元數(shù)以及校對后的AOD值進行左右兩側對比取得百分值為最終病理數(shù)據(jù)。
　　7、統(tǒng)計學方法:
　　本實驗所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用“均數(shù)±標準差”表示，立體定向術前后的行為學數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用配對

12、樣本t檢驗，組間及組內行為學數(shù)據(jù)的比較采用One-way ANOVA及Bonferroni post hoc檢驗方法。SNC及CPU內TH的表達水平與行為學參數(shù)間的相關性采用Pearson's相關分析方法。所有校驗以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、應用IPP6.0圖像分析軟件測量出TH陽性神經元數(shù)并與對側進行對比發(fā)現(xiàn)，同側的黑質致密部TH免疫陽性(THir)的神經元顯著減少，百分比值顯著減小。MFB組及

13、SNC組未注射6-OHDA的黑質致密部可見到較多的THir神經元，已注射6-OHDA的黑質致密部的THir神經元大部分消失（其中MFB組損毀側與健側對比7.3±4.4％;SNC組為12.6±8.2％）。大鼠的左右側THir神經元細胞計數(shù)結果相比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而相比之下，CPU組損毀效果較輕（損毀側與健側對比為35.3±15％）。各組的PD模型成功。應用IPP6.0圖像分析軟件從CPU四個冠狀層面(+1.2，0.8，0

14、.00 and-0.4mm)測量免疫反應陽性纖維的平均光密度(AOD)，結果與細胞計數(shù)類似。對側進行對比下同側的紋狀體TH免疫陽性神經纖維的AOD值顯著減少，百分比值顯著減小。MFB組及SNC組健側可測得較高的AOD值，損毀側的紋狀體的AOD值大幅降低（其中MFB組損毀側與健側對比7.7±3.5％; SNC組為12.7±8.1％）。大鼠的左右側TH免疫陽性神經纖維的AOD值結果相比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而相比之下，CPU組損

15、毀效果較輕(損毀側與健側對比為35.4±14.6％)。通過單因素方差相關分析可以發(fā)現(xiàn)MFB組與SNC組的模型在病理表現(xiàn)上要比CPU組損毀更徹底(P＜0.05)，而MFB組與SNC組之間的PD模型的TH損毀程度并沒有統(tǒng)計學上差異(P＞0.05)。
　　2、手術后4周，PD模型大鼠的步幅、擺動速度、患側肢體的最大接觸面積以及平均壓力比術前減少，然而支撐相時間、步幅周期、后側肢體的支撐相比例、終末雙側站立時間、以及支撐基數(shù)較術前增大，差

16、異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、另一方面，MFB組在各個步態(tài)參數(shù)上要比CPU組損毀更徹底，而SNC組與MFB組類似，除了支撐相比例這一參數(shù)外，其余參數(shù)均比CPU組損毀嚴重。然而，MFB組與SNC組之間平均平均壓力、步幅、擺動速度、步幅周期、支撐相比例、以及終末雙側站立時間對比有統(tǒng)計學差異(all P＜0.05)。
　　4、最后本實驗發(fā)現(xiàn)MFB組和SNC組PD模型大鼠在腳爪最大接觸面積、平均壓力以及終末雙側站立時間

17、這三個參數(shù)上左右肢體間存在統(tǒng)計學差異(all P＜0.05)。而CPU組PD模型大鼠除了前腳爪的最大接觸面積(患側小于健側，P＜0.05)和四肢終末雙側站立時間（患側長于健側，P＜0.01）左右側肢體間存在統(tǒng)計差異外，其他參數(shù)左右肢體間均無統(tǒng)計學差異。
　　5、PD大鼠的擺動速度、步幅、患側肢體的爪印最大接觸面積以及平均壓力與TH免疫陽性水平成顯著正相關。而支撐相時間、終末雙側站立時間、步幅周期、支撐相比例以及前肢的支撐基數(shù)與TH