一種帕金森病三維細(xì)胞模型的構(gòu)建和分析.pdf

1、目的:
　　在體外通過(guò)建立三維細(xì)胞培養(yǎng)方式，為體外研究帕金森病發(fā)生及治療機(jī)制提供一種新的、更接近人體的模型。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)首先利用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH與鼠尾Ⅰ型膠原建立起三種培養(yǎng)模式:1.三維細(xì)胞模型培養(yǎng);2.鼠尾Ⅰ型膠原鋪板后再將SK-N-SH細(xì)胞種植在這種單層膠原鋪板的孔板上，我們稱作coated細(xì)胞模型培養(yǎng);3.直接將細(xì)胞鋪在孔板上，稱作二維細(xì)胞模型培養(yǎng)。利用環(huán)境毒素1-甲基-4-苯基吡啶(

2、MPP+)處理以上三種培養(yǎng)模型，建立帕金森病體外疾病細(xì)胞模型。用MTT方法分析各細(xì)胞模型在藥物處理后的細(xì)胞活性;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QPCR)的方法檢測(cè)各個(gè)模型在藥物處理后α-synuclein表達(dá)量的變化;倒置光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡及HE染色方法比較三維模型中SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)藥物處理前后形態(tài)的變化。免疫熒光檢測(cè)α-synuclein在不同模型中經(jīng)藥物處理前后的表達(dá)變化。所有數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組比較采用成組t檢驗(yàn)。<

3、br>　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞對(duì)MPP+的毒性敏感性下降:
　　MTT比色法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MPP+對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH具有損傷作用，其損傷作用具有劑量依賴性。在傳統(tǒng)二維培養(yǎng)中，MPP+(1mmol/L)處理SK-N-SH細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞活力較對(duì)照組明顯下降(50.7％)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01），但是在三維模型組與coated細(xì)胞模型組中，我們發(fā)現(xiàn)MPP+處理24小時(shí)后，細(xì)胞活性較對(duì)照組下降不明顯，為對(duì)照組

4、的74.5％。且三維細(xì)胞模型組的細(xì)胞經(jīng)藥物處理48小時(shí)后，細(xì)胞活性與對(duì)照組相比僅降低33.8％。
　　2、細(xì)胞在三維模型表面的形態(tài)特點(diǎn):
　　掃描電鏡顯示，Ⅰ型膠原材料制成的三維模型呈纖維樣交織，并有一定的空隙。細(xì)胞在三維模型里面呈類球形生長(zhǎng)，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間突起交匯。與對(duì)照組相比，MPP+處理后24小時(shí)，處理組中的細(xì)胞出現(xiàn)皺縮趨勢(shì)，細(xì)胞突起縮短，減少。三維模型表面出現(xiàn)的異常高密度聚合物，我們猜測(cè)是皺縮的細(xì)胞。但在三維模型切片，

5、HE染色顯示，從模型的頂部到底部都有細(xì)胞分布，經(jīng)過(guò)MPP+處理24小時(shí)后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯的改變。
　　3、Alpha-synuelein表達(dá)量增加:
　　MPP+處理24小時(shí)后，三維模型組α-synuclein表達(dá)量與對(duì)照組相比出現(xiàn)上升，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與傳統(tǒng)二維模型組及coated細(xì)胞模型組相比（分別為5.2倍，6.3倍），其僅上升了1.9倍。
　　4、Alpha-synuclein聚合物從細(xì)

6、胞核向細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞基質(zhì)轉(zhuǎn)移:
　　MPP+處理24小時(shí)后，三維模型α-synuclein蛋白在核周圍聚集明顯增多，可以觀察到在細(xì)胞質(zhì)及臨近細(xì)胞膜部分有較大顆粒狀α-synuclein聚合物沉積，而在MPP+處理48小時(shí)后，核周及細(xì)胞基質(zhì)中的α-synuclein聚集現(xiàn)象不明顯，提示24小時(shí)后，α-synuclein聚合物已從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞外轉(zhuǎn)移。在傳統(tǒng)二維模型組及coated組中僅發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞的α-synuclein表達(dá)出現(xiàn)增加

7、，而并未發(fā)現(xiàn)α-synuclein聚合物沉積的現(xiàn)象。
　　結(jié)論:
　　1、三位細(xì)胞模型培養(yǎng)狀態(tài)下，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH對(duì)MPP+的毒性敏感性下降;
　　2、在體外展示了在三維環(huán)境中的細(xì)胞形態(tài)，以及在藥物處理之后的形態(tài)變化;
　　3、三維模型在MPP+處理24小時(shí)后觀察到α-synuclein表達(dá)量增加，異常聚集，并且發(fā)生異位。
　　本研究首次利用三維細(xì)胞培養(yǎng)模型經(jīng)過(guò)藥物處理成功構(gòu)建體外帕金森疾病模