基于肝腸軸功能改變對(duì)非酒精性脂肪肝發(fā)病與治療的研究.pdf

1、目的：高脂飲食誘導(dǎo)大鼠建立非酒精性脂肪肝模型，動(dòng)態(tài)觀察建模過(guò)程中腸道菌群改變，比較抑制菌群后對(duì)大鼠脂肪肝形成的影響；對(duì)已成功建模的NAFLD大鼠給予抗生素或低熱量常脂飲食干預(yù)，觀察大鼠腸道菌群改變及脂肪肝程度的差異。
　　方法：實(shí)驗(yàn)一：
　　選取SPF級(jí)72只SD大鼠隨機(jī)分為高脂飲食組（FD組）、抗生素預(yù)處理組（KY組）及ND組。對(duì)照組予以標(biāo)準(zhǔn)飼料飲食，正常飲水；FD組大鼠給予高脂飼料飲食，正常飲水；KY組則給予高脂飲食，飲

2、用抗生素溶液。動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)改變，于1w,2w,3w,4w周末隨機(jī)處死各組中6只，留取回腸末端糞便樣本,應(yīng)用16s rRNA熒光定量PCR方法分析大鼠腸道主要菌群的變化，并取大鼠肝臟組織進(jìn)行HE染色，對(duì)其組織病理學(xué)改變進(jìn)行評(píng)分，酶比法測(cè)量血清及肝臟組織甘油三酯（TG），膽固醇（TC），高密度脂蛋白（HDL），低密度脂蛋白(LDL)含量，及血清AST,ALT值，免疫組化聯(lián)合RT-PCR測(cè)定肝臟FIAF的表達(dá)水平。
　　實(shí)

3、驗(yàn)二：
　　選取96只SPF級(jí)SD大鼠，經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)成功建立NAFLD模型，排除體重指數(shù)低于正常對(duì)照組，分為模型組(NAFLD)、抗生素后處理組（KH）、限食組（XZ）及正常對(duì)照（ND）組共4組，正常對(duì)照組予以標(biāo)準(zhǔn)飲食飲水；NAFLD組繼續(xù)高脂自由飲食，正常飲水；限食組給予60％限制標(biāo)準(zhǔn)飲食，正常飲水；抗生素處理組則繼續(xù)高脂飲食，同時(shí)自由飲用抗生素溶液。動(dòng)態(tài)觀察各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)改變，于5w,6w,8w,10w周末隨機(jī)處死各組中

4、6只，留取回盲部糞便樣本,檢測(cè)指標(biāo)同實(shí)驗(yàn)1。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一：
　　1）FD組大鼠攝食量及固定時(shí)段活動(dòng)量均低于ND及KY組，但累積總能量攝入顯著高于其余兩組。各組大鼠體重隨喂養(yǎng)時(shí)間推移均逐漸增長(zhǎng)，其中FD尤為明顯，至第4周已顯著高于ND組，KY組則增長(zhǎng)趨勢(shì)較為緩慢，與ND組無(wú)明顯差異。各組不同時(shí)段除HDL、ALT外，血清或肝臟糖脂代謝指標(biāo)比較，依次為FD組>KY組>ND組，且差距逐漸增大，至第4周FD組上述指標(biāo)含量顯著高于

5、其余兩組，所有組別大鼠間血清HDL、ALT無(wú)明顯增高或降低趨勢(shì)（P>0.05），各組間兩兩比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2）HE染色提示隨高脂喂養(yǎng)時(shí)間推移FD組大鼠肝臟組織脂肪變程度逐漸加深，出現(xiàn)大小不一的圓形脂滴空泡，局部見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，抗生素預(yù)處理組肝臟NAS評(píng)分雖亦呈上升趨勢(shì)，但均值水平低于FD組，且于喂養(yǎng)第4周出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。3）各組大鼠肝臟組織FIAF的表達(dá)水平與脂肪變嚴(yán)重程度正相關(guān)，免疫組化與RT-PCR結(jié)果相一致，

6、其中FD組表達(dá)量高于KY組，至實(shí)驗(yàn)第4周出現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），KY組于實(shí)驗(yàn)起始2周出現(xiàn)“一過(guò)性升高”。4)乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量在FD組中呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，且相對(duì)定量低于正常組(實(shí)驗(yàn)第3、4周，P<0.05)；腸球菌則呈上升趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)第2周始顯著高于ND組（P<0.05）；各組腸桿菌變化無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。KY組表現(xiàn)為干預(yù)起始2周明顯菌群抑制，上述各腸道菌群均低于ND組及FD組含量，后2周趨于平穩(wěn)。
　　實(shí)驗(yàn)二：

7、>　　1）維持高脂飲食組（NAFLD+KH）大鼠體重、累積能量攝入均高于ND及XZ組，平均自主活動(dòng)次數(shù)較之則明顯減少，其中XZ組日活動(dòng)最頻繁。NAFLD組大鼠除HDL、ALT外，血清及肝臟糖脂代謝指標(biāo)均呈升高趨勢(shì)，經(jīng)抗生素干預(yù)治療，KH組上升趨勢(shì)減緩，于第10周顯著低于NAFLD（P<0.05），限制飲食后效果上述生化指標(biāo)出現(xiàn)不同程度逐漸下降趨勢(shì)。2）HE染色提示XZ組肝臟脂肪變程度可逆轉(zhuǎn)，而KH組則較之NAFLD進(jìn)展緩慢。3）免疫組化

8、及RT-PCR結(jié)果均提示NAFLD、KH組FIAF表達(dá)量存在不同程度升高，NAFLD尤為顯著，而XZ表達(dá)量減弱或陰性表達(dá)。3）給予抗生素治療干預(yù)，實(shí)驗(yàn)大鼠腸道菌群表達(dá)量均明顯抑制。乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量在NAFLD組中呈現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，至8、10周較NAFLD明顯增多（P<0.05），XZ組則變化趨勢(shì)相反。腸球菌在NAFLD組表達(dá)水平漸降，而XZ組呈現(xiàn)逐漸增加趨勢(shì)，二者有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：腸道微生態(tài)是NA