葛根總黃酮對不同淋巴系細(xì)胞增殖及凋亡的影響.pdf

1、第一部分，葛根是江蘇省中醫(yī)院獨創(chuàng)中藥復(fù)方制劑“血復(fù)康”的主要成分。血復(fù)康多年來用于慢性髓細(xì)胞白血病(chronicmyeloidleukemia，CML)的輔助治療，取得一定臨床療效。體外研究亦證實血復(fù)康可以通過降低BCR/ABL融合基因、JWA基因等表達(dá)誘導(dǎo)K562細(xì)胞（人慢性粒細(xì)胞白血病紅白血病變細(xì)胞株）凋亡。
　　 課題組多年來對葛根主要有效活性成分——葛根總黃酮(Puerariaeradixflavones，PRF)的深

2、入研究發(fā)現(xiàn)，PRF具有良好的抗白血病細(xì)胞效應(yīng)。從細(xì)胞和分子水平證明一定濃度PRF體外干預(yù)4種急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，AML)細(xì)胞株Kasumi-1、HL-60、NB4和U937，PRF呈濃度／時間依賴性抑制4種AML細(xì)胞株增殖，作用差異顯著，其強(qiáng)度依次為NB4細(xì)胞＞Kasumi-1細(xì)胞＞U937細(xì)胞＞HL-60細(xì)胞。進(jìn)一步研究PRF作用最明顯的急性早幼粒細(xì)胞白血病(acutepromyelocyticl

3、eukemia，APL)細(xì)胞株NB4，發(fā)現(xiàn)較低濃度(10～50μg/ml)PRF在體外即可誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡，且與1μM三氧化二砷(arsenictrioxide，ATO)具有協(xié)同作用，其分子機(jī)制可能與活化JNK信號途徑，激活caspase凋亡相關(guān)家族蛋白表達(dá)，下調(diào)特征性致病融合基因PML-RARα及抗凋亡相關(guān)基因等有關(guān)。小鼠體內(nèi)實驗亦證實，PRF可一定程度的改善NB4異種移植裸鼠的生活質(zhì)量。同時，課題組研究也發(fā)現(xiàn)，一定濃度PRF可以誘

4、導(dǎo)具有特征性致病融合基因AML1-ETO的AML-M2細(xì)胞株Kasumi-1凋亡，其機(jī)制主要是通過啟動內(nèi)源性凋亡途徑，與降解致病融合基因無關(guān)。在此基礎(chǔ)上，本課題圍繞PRF體外對不同淋巴系細(xì)胞株增殖及凋亡的影響進(jìn)一步開展探索性實驗研究。
　　 [實驗?zāi)康腯
　　 1、證實PRF在體外對不同淋巴系細(xì)胞株增殖的影響。
　　 2、選擇PRF增殖抑制最顯著的細(xì)胞株初步探討PRF在淋巴系細(xì)胞的可能作用及機(jī)制。
　　

5、[實驗方法]
　　 1．0～200μg/mlPRF分別處理U266細(xì)胞、RPMI8226細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞48及72h，MTT法檢測各細(xì)胞的增殖抑制率；篩選IC50值。
　　 2．0、10、30、50、100μg/mlPRF分別處理U266細(xì)胞、RPMI8226細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞48h，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　 3．0、10、30、50、100μg/mlPRF處理U266細(xì)胞48h，瑞氏染色法觀

6、察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；FITC-AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞早期凋亡率改變。
　　 4．以空白細(xì)胞為陰性對照，NB4細(xì)胞為陽性對照，將U266細(xì)胞與100μg/mlPRF共培養(yǎng)48h，苯酚／氯仿法抽提DNA，2％瓊脂糖凝膠電泳，觀察DNA片段。
　　 [實驗結(jié)果]
　　 1．不同濃度(0～200μg/ml)的PRF單藥處理U266、RPMI8226及Jurkat3種淋巴系細(xì)胞株48及72h，發(fā)現(xiàn)不同濃度PRF

7、可不同程度的抑制上述3種細(xì)胞增殖，強(qiáng)度依次為U266細(xì)胞＞RPMI8226細(xì)胞＞Jurkat細(xì)胞，呈濃度依賴性，但并無明顯時間依賴性。其中以U266細(xì)胞作用最顯著,48及72h的IC50分別為42.39及42.26μg/ml。
　　 2．流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞隨藥物濃度的增加，細(xì)胞凋亡峰(sub-G1)逐漸增高，但細(xì)胞周期進(jìn)程變化不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。
　　 3．不同濃度(0、10、30、

8、50、100μg/ml)PRF作用于U266細(xì)胞48h，瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)隨PRF濃度的增加，U266細(xì)胞數(shù)明顯減少，但實驗組較對照組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，未出現(xiàn)典型凋亡形態(tài)；AnnexinV+/PI-檢測細(xì)胞早期凋亡率改變發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞早期凋亡率呈劑量依賴性增高，分別為(5.20±0.92)%、(7.30±1.22)%、(8.10±0.53)%、(10.80±0.90)%，正常細(xì)胞對照組凋亡率為(3.20±0.36)%，組間差異具

9、有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4．DNA片段化分析發(fā)現(xiàn)，100μg/mlPRF干預(yù)48h后的NB4細(xì)胞出現(xiàn)DNA片段，細(xì)胞染色質(zhì)DNA裂解成180～200bp大小不等的片段，相同藥物濃度干預(yù)48h的U266細(xì)胞則表現(xiàn)為彌散的電泳條帶，未出現(xiàn)凋亡細(xì)胞特有的DNA梯帶。
　　 [結(jié)論]
　　 1．一定濃度PRF對三種淋巴系來源細(xì)胞株具有選擇性抑制作用，尤其對兩種多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，M

10、M)細(xì)胞株抑制作用較明顯，對T細(xì)胞性急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphoblasticleukemia，ALL)細(xì)胞株Jurkat則不明顯。
　　 2．一定濃度PRF可部分誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，但并不是其增殖抑制的主要機(jī)制。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，我們認(rèn)為PRF對不同的髓系及淋巴系細(xì)胞株均具有選擇性抑制作用，兩者作用機(jī)制可能不同。PRF抑制髓系細(xì)胞增殖主要是通過誘導(dǎo)凋亡實現(xiàn)的，但本研究所及三種淋巴系細(xì)胞株雖可能涉及凋亡相關(guān)