孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限的關(guān)聯(lián)及其機制研究.pdf

1、孕期母體鎘暴露與胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）的關(guān)聯(lián)尚存在爭議。本課題擬用實驗室前期建立的中國安徽出生隊列研究（China-Anhui Birth Cohort Study，C-ABCS）平臺，以合肥出生隊列3352對單胎母嬰為樣本人群，分析孕期不同階段鎘暴露分別與低出生體重（low birth weight，LBW）和小于胎齡兒（small for gestational age，SGA）的關(guān)

2、聯(lián)強度；在成功建立鎘誘導(dǎo)胎鼠生長受限的孕鼠模型基礎(chǔ)上，觀察鎘在母體、胎盤和胎體內(nèi)的分布和代謝情況以及對胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害效應(yīng)；探討孕期鎘暴露對小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用，并進一步研究鎘對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用；研究自由基清除劑 N-叔丁基-α-苯基硝酮（N-tert-butyl-α-phenylnitrone，PBN）對鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的拮抗效應(yīng)，以闡明活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用；探討IRE1小干擾RNA（

3、small interfering RNAs，siRNAs）轉(zhuǎn)染對鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵表達的拮抗效應(yīng)，以闡明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme1，IRE1）信號通路在鎘損害人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能中的作用。本研究為最終闡明孕期母體鎘暴露引起胎兒生長受限的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分：孕期鎘暴露與胎兒生長受限（FGR）關(guān)聯(lián)的人群研究
　　目的：探討孕期不同階段鎘暴露分

4、別與低出生體重（LBW）和小于胎齡兒（SGA）的關(guān)聯(lián)強度。
　　方法：本研究從C-ABCS中選擇合肥出生隊列，抽取該隊列已經(jīng)收集的3352例孕婦和新生兒出生資料、孕婦血清標(biāo)本，用石墨爐原子吸收分光光度法檢測孕婦血清鎘含量。
　　結(jié)果：鎘檢測結(jié)果顯示，該隊列孕婦平均血清鎘含量為0.89μg/L。按照孕婦血清鎘含量≥P75分為高鎘組，而血清鎘含量＜P75低鎘組，分析孕期不同階段母體高鎘暴露引起LBW和SGA發(fā)生的RR及其95％C

5、I。整個孕期3352例孕婦資料分析結(jié)果表明，孕期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為4.3%（RR為2.25；95%CI：1.45，3.49；P<0.001），在控制孕期BMI、孕婦年齡、月平均收入和孕婦血清采集時間等變量后，高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為2.21（95%CI：1.43，3.42；P<0.001）；孕期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為10.5%（RR為1.43；95%CI：1.09，1.86；P=0.009），調(diào)整RR為1.41

6、（95%CI：1.08，1.85；P=0.011）。孕早期1122例孕婦資料分析結(jié)果顯示，孕早期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為2.5%（RR為1.26；95%CI：0.52，3.08；P=0.608），在控制孕期BMI、孕婦年齡和月平均收入等變量后，高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為1.26（95%CI：0.52，3.08；P=0.606）；孕早期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為9.4%（RR為1.20；95%CI：0.75，1.93；P=0

7、.446），調(diào)整RR為1.18（95%CI：0.73，1.90；P=0.498）。孕中晚期2230例孕婦資料分析結(jié)果顯示，孕中晚期高鎘暴露組新生兒LBW發(fā)生率為5.2%（RR為2.70；95%CI：1.63，4.49；P<0.001），在控制孕期 BMI、孕婦年齡和月平均收入等變量后，高鎘暴露誘導(dǎo)新生兒發(fā)生LBW的RR為2.79（95%CI：1.68，4.66；P<0.001）；孕中晚期高鎘暴露組SGA發(fā)生率為11.1%（RR為1.55

8、；95%CI：1.12，2.13；P=0.008），調(diào)整RR為1.54（95%CI：1.11，2.12；P=0.009）。
　　結(jié)論：孕中晚期母體高鎘暴露顯著升高LBW和SGA發(fā)生風(fēng)險。
　　第二部分：孕期鎘暴露損害胎鼠發(fā)育和胎盤結(jié)構(gòu)與功能的動物實驗研究
　　目的：探討孕期鎘暴露對胎鼠發(fā)育和胎盤結(jié)構(gòu)與功能的損害作用。
　　方法：本研究由3個實驗組成。實驗1，本研究采用兩種方法建立胎兒生長受限的孕鼠模型，一種方法是

9、受孕第9天（gestational day9，GD9）小鼠經(jīng)腹腔單次給予氯化鎘（4.5 mg/kg）溶液，另一種方法是受孕第13天至17天（GD13-17）小鼠每日上午經(jīng)腹腔注射單次給予氯化鎘（0.5 mg/kg）溶液。兩種方法均于GD18早晨剖殺孕鼠，然后測量胎鼠身長和重量。實驗2，為了探討孕期母體鎘暴露對母體、胎盤和胎體鎘分布的近期和遠期影響，受孕第9天小鼠被腹腔單次給予氯化鎘（4.5 mg/kg），GD10和GD18分別剖殺孕鼠，

10、收集母鼠（血清、肝臟和腎臟）、胎盤和胎鼠相關(guān)標(biāo)本，用石墨爐原子吸收分光光度法檢測樣品鎘含量。實驗3，為了探討孕期母體鎘暴露對小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能的影響，受孕第9天小鼠被單次腹腔注射NS或氯化鎘（4.5 mg/kg），于GD10和GD18分別收集小鼠胎盤。GD18小鼠胎盤被稱重和測量胎盤直徑，GD10和GD18部分胎盤固定后做組織病理學(xué)檢查，部分胎盤提取RNA行定量PCR檢測。
　　結(jié)果：實驗1結(jié)果顯示，孕中期單次鎘暴露或孕晚期多次鎘

11、暴露均明顯降低胎鼠身長和體重，而母鼠無明顯中毒體征。這提示，孕期母體鎘暴露誘導(dǎo)胎鼠生長受限。實驗2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GD9小鼠被鎘處理后，GD10母鼠血清、肝臟和腎臟鎘含量分別升高2.8、80.5和13.4倍，GD10胎盤和胚胎分別升高60.2和11.5倍；GD18母鼠血清、肝臟和腎臟鎘含量分別升高2.2、300.9和34.3倍，GD18胎盤和胚胎分別升高47.4和4.9倍，而GD18胎鼠血清鎘含量無變化。這些研究結(jié)果充分提示，進入母體的鎘在胎

12、盤組織蓄積，僅有少量鎘透過胎盤屏障進入胎鼠體內(nèi)。實驗3結(jié)果表明，孕期鎘暴露明顯減輕小鼠胎盤重量和降低胎盤直徑。HE染色結(jié)果顯示，孕期母體鎘暴露明顯減少胎盤迷路層平均血竇區(qū)面積；TUNEL染色和增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）免疫染色結(jié)果表明，孕期母體鎘暴露明顯促進胎盤細(xì)胞凋亡和抑制胎盤細(xì)胞增殖。定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孕期母體鎘暴露明顯下調(diào)小鼠胎盤營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵（Glut

13、1、Znt1、Zip1和Pcft）、生長因子及其受體（Pgf、Igf2、Vegfr1和Igf2r）mRNA表達。這些結(jié)果提示，孕期母體鎘暴露明顯引起小鼠胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙。
　　結(jié)論：孕期母體鎘暴露引起胎盤鎘蓄積，導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙，并誘發(fā)胎鼠生長受限。
　　第三部分：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞功能中的作用及其機制研究
　　目的：探討活性氧在鎘誘發(fā)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IRE1信號在鎘損害胎盤功

14、能中的作用。
　　方法：本實驗由3個實驗組成。實驗1，為了探討鎘對小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)的影響，受孕第9天小鼠被單次氯化鎘（4.5 mg/kg），于鎘處理后0、2、8和24 h收集小鼠胎盤，分別檢測不同時點小鼠胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因與蛋白的表達情況。實驗2，為了探討活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的調(diào)控作用，受孕第9天小鼠在氯化鎘（4.5 mg/kg，i.p.）處理前0.5 h和處理后4 h給予PBN

15、（100 mg/kg，i.p.），于鎘處理后8和24 h收集小鼠胎盤，檢測胎盤氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)。實驗3，為了探討未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE-1α信號通路在鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵和生長因子表達中的作用，人JEG-3細(xì)胞在鎘處理前轉(zhuǎn)染IRE-1siRNAs，于鎘處理后12 h收獲細(xì)胞，用定量RT-PCR技術(shù)檢測營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵和生長因子mRNA表達。
　　結(jié)果：實驗1結(jié)果顯示，孕期母體鎘暴露明顯上調(diào)小鼠胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

16、和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因（Grp78和Atf4）mRNA及相關(guān)蛋白（GRP78，peIF2α和CHOP）表達。細(xì)胞實驗還發(fā)現(xiàn)，不同濃度的鎘顯著上調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白（pIRE1α、peIF2α、CHOP、pJNK和GRP78）表達，但存在時間效應(yīng)，鎘暴露2 h后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞GRP78蛋白表達明顯上調(diào)，而12 h和24 h后GRP78蛋白表達卻顯著下調(diào)；鎘暴露6 h后胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞pIRE1α蛋白表達明顯上調(diào)，而

17、24 h的pIRE1α蛋白水平卻低于0 h；隨著時間增加，胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞peIF2α、CHOP和pJNK蛋白表達均逐漸升高。上述結(jié)果提示，鎘顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)。實驗2結(jié)果表明，自由基清除劑PBN顯著對抗鎘上調(diào)胎盤組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（GRP78、peIF2α和CHOP）表達，緩解鎘對小鼠胎盤還原型谷胱甘肽（GSH）的耗竭，且拮抗鎘上調(diào)胎盤組織3-硝基酪氨酸（3-NT）和血紅素氧化酶1（HO-1）蛋白表達。這些

18、研究結(jié)果提示，活性氧至少部分介導(dǎo)鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。實驗3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鎘處理明顯下調(diào)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵（GLUT1、FATP4、PCFT）和生長因子（PGF和IGF2）mRNA表達，IRE-1 siRNA預(yù)處理明顯對抗鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞生長因子（PGF和IGF2）mRNA表達，而對鎘下調(diào)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運泵（GLUT1、FATP4、PCFT）mRNA表達無影響。上述結(jié)果提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE-1信號部分介導(dǎo)

19、鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能。
　　結(jié)論：鎘暴露顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，活性氧在鎘誘導(dǎo)胎盤內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中起關(guān)鍵作用，而未折疊蛋白反應(yīng)下游IRE1通路在鎘損害胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)分泌功能中起重要作用。
　　綜合以上三部分研究結(jié)果，本文得出如下結(jié)論：（1）孕期母體鎘暴露顯著升高胎兒生長受限的發(fā)生風(fēng)險；（2）孕期母體鎘暴露引起胎盤鎘蓄積，導(dǎo)致胎盤結(jié)構(gòu)與功能障礙，并誘發(fā)胎鼠生長受限；（3）鎘顯著誘導(dǎo)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)