GOLPH2(GP73)表達及其干預(yù)預(yù)測并調(diào)節(jié)原發(fā)性肝癌術(shù)后IFNα治療效果及其機制研究.pdf

1、肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)（簡稱肝癌）是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤死因第三位、我國惡性腫瘤死因第二位（全世界半數(shù)以上病例發(fā)生在我國）。在歐洲和美國，由于受丙型肝炎感染的影響，近年來發(fā)病率也呈上升趨勢。近年來隨著肝癌診斷和治療技術(shù)的進步，部分患者通過早期診斷及早期根治切除獲得了較好的療效，根治切除術(shù)后的十年生存率已提高到30％左右。當(dāng)前，手術(shù)切除仍是病人獲得長期生存

2、最有效的途徑，但目前只有10％-20％肝癌病人在診斷時具有根治性治療的機會;即使是根治性切除，其術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達60％-70％。其他治療方式，諸如經(jīng)動脈導(dǎo)管化療栓塞(TACE)、索拉菲尼（Sorafenib）及干擾素(IFNα)治療可使一部分患者獲益，然而，由于無法區(qū)分哪些患者適合這類輔助性治療及患者對此類藥物副作用耐受不一，其治療效果不盡人意。尋找能夠區(qū)分和預(yù)測患者對此類治療是否敏感的分子指標(biāo)及提高藥物療效的分子干預(yù)對提高肝癌患者

3、生存具有重要意義。
　　IFNα是重要的腫瘤免疫治療藥物，已獲美國FDA批準(zhǔn)用于多種病毒性疾病和惡性腫瘤的治療。包括我所在內(nèi)的多家中心所開展的很多隨機臨床對照試驗表明肝癌術(shù)后長療程（＞18個月）IFNα治療是減少復(fù)發(fā)、提高生存的有效方法。然而國內(nèi)肝癌患者絕大多數(shù)伴有乙肝肝硬化背景，肝臟代償功能較差，血小板和白細胞處于一個較低的水平。術(shù)后大劑量長療程IFNα治療對患者肝功能和白細胞、血小板均構(gòu)成了較為嚴(yán)重的影響，也增加了急性和慢性神

4、經(jīng)系統(tǒng)和血液系統(tǒng)損害等毒副作用，患者耐受性和依從性差。另外，患者對IFNα治療反應(yīng)不一，部分患者未能取得預(yù)期的治療效果。如何篩選哪些患者適合IFNα治療及在現(xiàn)有治療方法基礎(chǔ)上聯(lián)合新的干預(yù)手段提高IFNα治療敏感性是進一步提高IFNα防治效果的關(guān)鍵。
　　課題組前期將激光捕獲顯微切割(LCM)和基因芯片技術(shù)相結(jié)合，研究伴和不伴肝外轉(zhuǎn)移肝癌原發(fā)瘤之間基因表達譜的差異，發(fā)現(xiàn)了一組以高爾基體Ⅱ型膜蛋白GOLPH2(typeⅡ Golgi

5、membrane protein)（又稱GP73）為首、可能在肝癌轉(zhuǎn)移進程中起重要作用并可能成為肝癌轉(zhuǎn)移重要干預(yù)靶點的候選基因。已有報道GOLPH2在肝癌組織中表達顯著上調(diào)，可作為肝癌潛在診斷指標(biāo)。
　　本研究中，肝癌患者術(shù)后應(yīng)用IFNα治療臨床隨機對照試驗顯示，GOLPH2低表達的患者，術(shù)后輔助應(yīng)用IFNα治療能顯著延長其生存，而GOLPH2高表達患者術(shù)后輔助應(yīng)用IFNα治療，生存期未得到明顯改善;體內(nèi)外試驗中我們發(fā)現(xiàn)，抑制GO

6、LPH2表達后明顯增強IFNα的抑腫瘤增殖作用，而高表達GOLPH2明顯抑制IFNα的抑腫瘤增殖作用;進一步研究表明，作為高爾基體特異性跨膜蛋白，GOLPH2可能通過調(diào)節(jié)IFNα受體1(IFNαR1)的降解從而抑制干擾素作用的敏感性。當(dāng)前，肝癌術(shù)后應(yīng)用IFNα缺乏有效的預(yù)測指標(biāo)，IFNα抗腫瘤作用有待提高，IFNα受體在IFNα抗腫瘤中的作用鮮有報道，這些都制約了IFNα在肝癌臨床治療中的廣泛應(yīng)用。因此，GOLPH2作為潛在的肝癌患者應(yīng)

7、用IFNα治療預(yù)測指標(biāo)及干預(yù)靶點在臨床抗腫瘤研究中具有重要意義。
　　第一部分GOLPH2在預(yù)測肝癌術(shù)后IFNα治療效果中的價值
　　目的:評估肝癌術(shù)后IFNα隨機臨床對照治療試驗肝癌標(biāo)本組織中GOLPH2表達水平對肝癌術(shù)后IFNα治療效果的臨床預(yù)測價值。
　　方法:通過組織芯片免疫組化染色檢測142例肝癌術(shù)后應(yīng)用IFNα治療隨機臨床對照試驗肝癌組織GOLPH2的表達，分析GOLPH2在肝癌術(shù)后IFNα（文中要統(tǒng)一用I

8、FNα治療組（測試組;n=69）和非治療組（對照組;n=73）中的表達水平及其與肝癌術(shù)后IFNα治療效果的相關(guān)性。
　　結(jié)果:142例肝癌組織中，55例GOLPH2表達陽性，87例GOLPH2表達陰性。比較GOLPH2不同表達患者臨床病理資料，發(fā)現(xiàn)GOLPH2陰性肝癌術(shù)后接受IFNα治療（測試組）比不接受IFNα治療（對照組）可獲得更好的總體生存時間(OS，P=0.001);但GOLPH2陽性肝癌接受IFNα治療與否其OS沒有明顯

9、差異。Cox比例風(fēng)險回歸單因素/多因素分析均表明IFNα治療能顯著延長GOLPH2陰性肝癌患者的生存。
　　結(jié)論:GOLPH2可作為肝癌術(shù)后IFNα治療效果的有效預(yù)測指標(biāo)。
　　第二部分肝癌細胞GOPH2表達水平及其干預(yù)在體內(nèi)外實驗中對IFNα治療效果的影響
　　目的:通過慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾和過表達體系觀察GOLPH2不同表達水平肝癌細胞系對IFNα治療的敏感性及其在體內(nèi)外不同環(huán)境中的抑腫瘤作用。
　　方

10、法:運用實時熒光定量PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)比較分析GOLPH2表達水平與IFNα治療效果的關(guān)系。通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾/過表達技術(shù)構(gòu)建GOLPH2不同表達的肝癌細胞株，經(jīng)體內(nèi)外功能實驗明確GOLPH2表達水平及其干預(yù)對IFNα治療效果的影響。
　　結(jié)果: qRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，對IFNα干預(yù)敏感肝癌細胞系(Hep G2、PLC和BEL-7402)其GOLPH2 mRNA和蛋白水平均

11、顯著低于對IFNα抵抗細胞系（HCC-97H和MHCC-LM3）。體外實驗通過慢病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾和過表達體系獲得穩(wěn)定的GOLPH2高、低表達肝癌細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株HCC-97H、HCC-97H-shGOPH2以及BEL-7402、BEL-7402-GOLPH2，發(fā)現(xiàn)對IFNα敏感細胞系BEL-7402過表達GOLPH2后對IFNα治療抵抗，而IFNα抵抗肝癌細胞系HCC-97H抑制GOLPH2表達后對IFNα治療敏感。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)皮下接

12、種BEL-7402、7402-GOLPH2或HCC-97H、HCC-97H-shGOPH2細胞，并于第二周進行IFNα干預(yù)，過表達GOLPH2后IFNα抑制肝癌生長的作用明顯減弱;而降低GOLPH2后小劑量IFNα就能抑制肝癌細胞的生長。在原位肝癌移植瘤模型中，對HCC-97H-shGOPH2進行回補并IFNα干預(yù)，發(fā)現(xiàn)回補GOLPH2能恢復(fù)對IFNα干預(yù)的抵抗，而回補GOLPH2的突變體不能恢復(fù)其對IFNα的抵抗。
　　結(jié)論:G

13、OLPH2的不同表達水平顯著影響IFNα在體內(nèi)外的抗腫瘤作用，下調(diào)GOLPH2明顯促進IFNα的抗腫瘤作用，有望成為提高IFNα抗肝癌治療效果的干預(yù)靶點。
　　第三部分GOLPH2影響IFNα肝癌治療效果的機制
　　目的:探索GOLPH2不同表達影響IFNα肝癌治療效果的可能機制，為潛在的分子干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:通過慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾/過表達技術(shù)構(gòu)建GOLPH2不同表達肝癌細胞株，qRT-PCR和West

14、ern-blot等技術(shù)檢測IFNα經(jīng)典信號通路中多種分子轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的變化。通過蛋白質(zhì)譜分析GOLPH2可能調(diào)控的干擾素相關(guān)蛋白并進行功能分析。通過雙熒光素酶報告基因測試系統(tǒng)分析GOLPH2的不同表達能否影響IFNα信號通路中PISRE啟動子的結(jié)合及IFNα調(diào)控因子(IRFs)如P48的表達，探討GOLPH2不同表達影響IFNα作用效果的分子機制。
　　結(jié)果:不同肝癌細胞系IFNα干預(yù)12小時后，對IFNα敏感肝癌細胞BEL-7

15、402、PLC、HepG2其IFNαR1高表達，刺激后STAT1、STAT2及IRF9(P48)顯著上調(diào);不敏感肝癌細胞系HCC-97H、MHCCLM3其IFNαR1低表達，干預(yù)后STAT1、STAT2及IRF9(P48)無明顯變化。BEL-7402過表達GOLPH2后，IFNαR1轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異，但蛋白水平有所降低;HCC-97H降低GOLPH2后，IFNαR1轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]變化，蛋白水平有所升高，說明GOLPH2參與了IFNαR1的降

16、解。蛋白質(zhì)譜分析顯示GOLPH2有可能調(diào)控IFNαR1，進一步研究發(fā)現(xiàn)，GOLPH2通過AP2調(diào)控IFNαR1的泛素化降解從而抑制IFNα的相關(guān)功能。雙熒光素酶報告基因測試顯示GOLPH2的不同表達影響了IFNα信號通路中ISRE啟動子的結(jié)合，熒光共聚焦及RT-PCR和Western-blot顯示GOLPH2能影響IFNα調(diào)控因子IRF9(P48)的表達及分布。
　　結(jié)論:GOLPH2通過影響IFNαR1降解及其下游信號通路影響干