番茄果實后熟與葉片衰老相關的SlWRKY轉錄因子功能分析.pdf

1、番茄（Solanum lycopersicum）是典型的呼吸躍變型果實，在后熟過程中發(fā)生了許多重要的生理變化。在激素水平上，伴隨著乙烯的大量合成；在顏色轉變上，葉綠素的降解和番茄紅素的合成使番茄果實在外觀上由綠轉紅；在果實質地上，由于水解酶的作用使果實逐漸軟化。WRKY轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，已有的研究表明 WRKY轉錄因子在植物形態(tài)建成、物質代謝、生物及非生物脅迫響應等過程中發(fā)揮了重要的調控作用。近年來在擬南芥、水稻等模式植

2、物上的研究已經(jīng)表明 WRKY轉錄因子參與了對植物葉片衰老的調控，但對采后果實后熟調控方面的研究非常罕見。本論文在本課題組的研究基礎上，以番茄為實驗材料，分析了對乙烯產(chǎn)生明顯響應的SlWRKY在葉片和果實中的表達模式、篩選其下游基因、驗證與其互作的蛋白，從多方面進一步探討了 WRKY轉錄因子是否參與了番茄果實后熟階段的調控。主要研究結果如下：
　　1、采用熒光定量技術檢測了9個 SlWRKY基因在四個發(fā)育時期的番茄葉片，六個自然成熟

3、時期番茄果實中的實時表達情況。結果表明，（1）SlWRKY16、SlWRKY17、SlWRKY22、SlWRKY23、SlWRKY25、SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54都在葉片初始進入衰老狀態(tài)時表達量最高，其中 SlWRKY25、SlWRKY33、SlWRKY54的變化幅度最大，相對幼葉的表達量升高了160-200倍；（2）SlWRKY16、SlWRKY17、SlWRKY22、SlWRKY23、Sl

4、WRKY25、SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54在番茄果實成熟期都有不同程度的上調表達，但具有不同的上調模式。（3）SlWRKY16、SlWRKY17、SlWRKY23、SlWRKY25表達量在粉紅期出現(xiàn)峰值，SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54在全紅期的表達量達到峰值。SlWRKY22的表達量則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。
　　2、使用熒光共聚焦顯微鏡觀察融合YFP的

5、重組載體在本氏煙草中的表達情況，結果表明：SlWRKY17、SlWRKY22、SlWRKY23、SlWRKY25、SlWRKY31、SlWRKY33、SlWRKY53、SlWRKY54均定位于細胞核。
　　3、將啟動子活性載體和過表達載體共同轉化煙草葉片，檢測SlWRKYs對衰老相關基因啟動子活性的影響，數(shù)據(jù)分析結果顯示：SlWRKY對SlACO1、SlACO3、SlPAO的啟動子活性沒有產(chǎn)生明顯影響；SlWRKY16、SlWRK

6、Y23、SlWRKY33、SlWRKY53使SlPPH啟動子的提高了2-3倍，SlWRKY25使SlPDS的啟動子活性上升了6倍。SlWRKY16、SlWRKY17也使SlPSY1的啟動子活性有2-3倍的提高。SlWRKY16和SlWRKY17的共同作用則表現(xiàn)出對SlPSY1啟動子更加強烈的調控作用，使其活性提高了接近4倍。
　　4、通過熒光雙分子互補實驗驗證SlWRKYs與轉錄因子SlERF2b、SlERF7、SlRIN之間是否

7、存在相互作用。結果表明，SlERF2b與 SlWRKY17、SlWRKY54，SlERF7與 SlWRKY17、SlWRKY33，SlRIN與 SlWRKY17、SlWRKY53、SlWRKY17與SlWRKY16、SlWRKY54之間均存在蛋白水平的互作關系。
　　5、對SlWRKY23、SlWRKY53進行原核表達，并純化獲得高純度的蛋白。這些蛋白在體外與包含W-box的核酸探針反應，結果顯示SlWRKY23能夠與SlACO1