截短型人骨保護素哺乳類載體的構(gòu)建、優(yōu)化及表達.pdf

1、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)是破骨細胞分化因子(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand，RANKL)的可溶性“誘騙”受體，能抑制破骨細胞的分化、成熟、活化及存活。它是一種分泌性糖蛋白，含21個信號肽和5個潛在的糖基化位點。成熟人OPG由7個結(jié)構(gòu)域組成，其中N-端有4個半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)，也是其生物活性所在部位。最初OPG以單體形式在細胞內(nèi)生成，再在第400個半胱氨酸(Cys

2、400)的位置以二硫鍵連成二聚體。 目前，雖有原核表達OPG的報道，但仍存在一些不足。例如，在大腸桿菌中表達真核蛋白，不能進行翻譯后修飾，諸如不能完成蛋白的糖基化、磷酸化和二硫鍵的形成等，所以很難制得具備天然活性的蛋白質(zhì)。真核細胞能夠表達具有生物功能的OPG，但存在的普遍問題是表達量不高。近年本室成功構(gòu)建了OPG的真核表達載體pcDNA3.1/DHFR-OPG，轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞后獲得了表達，但表達量不高，不能滿足后續(xù)實

3、驗的需要。本次研究在于進一步優(yōu)化已建立好的表達系統(tǒng)，并進一步對表達產(chǎn)物進行免疫原性鑒定和生物活性測定。 本次研究將通過對目的基因和載體結(jié)構(gòu)進行改進，以達到優(yōu)化表達的目的。在已有全長型人OPG重組哺乳類表達載體pcDNA3.1/DHFR-OPG的基礎(chǔ)上，利用PCR技術(shù)擴增截短型人OPGcDNA(含有21個信號肽序列、D1-D4結(jié)構(gòu)區(qū)和形成二硫鍵必需的Cys400)，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ將其克隆入構(gòu)建好的帶有二氫葉酸還原酶篩選

4、標(biāo)記的哺乳類表達載體pcDNA3.1/DHFR-GFP的相應(yīng)克隆位點，構(gòu)建成pcDNA3.1/DHFR-tOPG。并嘗試對載體進行優(yōu)化，以截短型OPG為模板，運用兩次PCR技術(shù)，在目的基因的5'端非翻譯區(qū)添加了一條長35bp的翻譯增強序列和一條長37bp的內(nèi)含子序列，構(gòu)建了表達載體pcDNA3.1/DHFR-netOPG。 按照LipofectmineTM2000Reagent說明書將上述已線性化載體分別轉(zhuǎn)入二氫葉酸還原酶(Di

5、hydrofolateReductase，DHFR)基因缺陷的CHO細胞中，首先在含5％透析血清的條件培養(yǎng)基IMEM中篩選出轉(zhuǎn)染成功的陽性克隆，經(jīng)ELISA測定篩選出的高表達細胞株，傳代后氨甲喋呤(methotrexate，MTX)梯度濃度加壓篩選。在MTX梯度濃度加壓作用下，可見重組蛋白的表達水平不斷增高，重組蛋白最高表達水平可達6ug/ml，但在同一濃度組優(yōu)化前后重組蛋白的表達量無明顯差異(p＞0.05)。經(jīng)WesternBlott

6、ing鑒定重組蛋白有免疫原性，截短型分子量大小在37.8kD左右。采用破骨細胞樣細胞(osteoclast-likecell，OCL)誘導(dǎo)分化抑制實驗來測定重組蛋白的生物學(xué)活性，證實重組蛋白能抑制單核/巨噬細胞集落刺激因子(MacrophageClony-Stimulatingfactor,MCS-F)和RANKL對多核OCL生成的協(xié)調(diào)促進作用，OCL的生成顯著減少(p＜0.05)。對同一高表達細胞株進行凍存，反復(fù)3次復(fù)蘇，重組蛋白的表