貴州矮馬腹瀉細(xì)菌的分離和鑒定.pdf

1、貴州矮馬是貴州偏遠(yuǎn)山區(qū)的彝族、苗族、回族、水族等少數(shù)民族經(jīng)過長期的人工選育和自然近交形成的珍貴矮馬資源，也是僅有的5個中國矮馬品種之一。貴州矮馬現(xiàn)存欄總數(shù)僅僅1400多匹，并且有不斷減少的趨勢。在飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)初生馬駒和成年矮馬時有腹瀉發(fā)生，嚴(yán)重影響矮馬的養(yǎng)殖。因此為了探究貴州矮馬的腹瀉病原細(xì)菌，本文以腹瀉糞樣為材料進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定以及毒力試驗研究。
　　7份腹瀉糞樣分別經(jīng)過SS和XLD培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)以及LB培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌分離

2、，革蘭氏染色觀察、生理生化檢驗以及16S rRNA基因序列比對分析進(jìn)行鑒定。得到7株沙門氏菌（命名為：S4、S6、S7、S10、S11、S15、S19），7株大腸桿菌（命名為：Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7、）和1株肺炎克雷伯菌（命名為T1）。其中分離得到的7株沙門氏菌菌株均可在SS和XLD瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)典型菌落形態(tài)，革蘭氏染色呈陰性；生理生化檢驗結(jié)果與沙門氏菌的生化特性相符，將分離的沙門氏菌的16S rRNA基因序列與NC

3、BI收錄的沙門氏菌的16S rRNA基因序列進(jìn)行比對，其相似度在98％～99％；分離的7株大腸桿菌可在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基和SS培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型菌落形態(tài)，革蘭氏染色陰性、生理生化檢驗符合大腸桿菌的生化特性，這些大腸桿菌的16S rRNA基因序列與NCBI收錄的大腸桿菌的16S rRNA基因序列的相似性最高達(dá)到99％；分離得到的1株肺炎克雷伯氏菌在LB培養(yǎng)基上呈圓形、隆起、乳白色、邊緣整齊帶有粘性的菌落，革蘭氏染色為陰性，生理生化檢驗符合肺炎克

4、雷伯氏菌的生理特性，克隆的16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的肺炎克雷伯氏菌的16S rRNA基因序列的相似性最高為99％。
　　通過對7份腹瀉糞樣進(jìn)行細(xì)菌分離和鑒定，從4份樣品中檢測出沙門氏菌，檢出率為57％；7份腹瀉糞樣中檢測出大腸桿菌，檢出率為100％；1份腹瀉糞樣中檢測出肺炎克雷伯氏菌，檢出率為14.3％。
　　為進(jìn)一步探究分離細(xì)菌是否存在相應(yīng)的毒素基因，根據(jù) NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的基因序列設(shè)計特異性引物，采

5、用PCR方法分別擴(kuò)增沙門氏菌侵襲蛋白A（invasion protein gene， invA）基因和大腸桿菌耐熱腸毒素（Heat-Stable toxin,ST）、熱敏腸毒素（Heat-Labile toxin,LT）、志賀樣毒素Ⅱ（Shiga-Like toxinⅡ,SLTⅡ）、外膜蛋白抗原43（outer membrane protein antigen43，AG43）基因以及肺炎克雷伯氏菌外膜孔蛋白E（outer membran

6、e protein E,phoE）基因。特異性條帶經(jīng)回收、測序，提交NCBI/BLAST比對，結(jié)果表明：分離的沙門氏菌具有侵襲蛋白 A基因序列；分離的大腸桿菌只獲得了外膜蛋白抗原43基因序列；分離的肺炎克雷伯氏菌具有 phoE基因。由此可見，分離獲得的菌株均具有毒素編碼基因，這些基因能編碼毒素蛋白，導(dǎo)致人或動物患腸炎，進(jìn)而引起腹瀉。
　　分離得到的沙門氏菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌雖含有毒素編碼基因，但它們的毒力未被證實。因此為探

7、究分離細(xì)菌的毒力，選擇沙門氏菌 S7、大腸桿菌 Y1和肺炎克雷伯氏菌T1進(jìn)行毒力測定。結(jié)果表明：沙門氏菌 S7對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為4.71×102 CFU，屬于強(qiáng)致病力菌株，大腸桿菌Y1對小鼠的半數(shù)致死量（LD50）為3.23×106CFU，肺炎克雷伯氏菌對小鼠的半數(shù)致死量為3.01×107CFU。分離的細(xì)菌均能夠引起試驗小鼠腹瀉，引起腸，心臟、肝臟、脾臟，肺，腎臟等不同程度的病變，能夠?qū)е滦∈笏劳觥?br>　　綜上所述，沙