酶促糖基化反應(yīng)參與糖尿病性視網(wǎng)膜病變發(fā)病機(jī)理的初步研究.pdf

1、目的：觀察糖尿病疾病狀態(tài)下，視網(wǎng)膜組織中的糖基轉(zhuǎn)移酶以及相關(guān)酶促糖基化反應(yīng)的改變情況，探討糖基轉(zhuǎn)移酶、酶促糖基化反應(yīng)參與糖尿病性視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)的相關(guān)機(jī)理。 方法：1．建立糖尿病大鼠模型，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-PCR)觀察糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織中部分糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)情況；凝集素染色(Lectin Blot)觀察視網(wǎng)膜組織蛋白相應(yīng)的糖基化修飾改變情況。2．原代培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微

2、血管周細(xì)胞(Bovine Retinal Perticyte，BRP)，含不同濃度葡萄糖(5 mM，10 mM，20 mM，30 mM)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)BRP細(xì)胞72 h，以5 mM濃度葡萄糖培養(yǎng)組作為正常對(duì)照；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ReverseTranscriptase-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)、細(xì)胞蛋白凝集素染色觀察不同濃度葡萄糖培養(yǎng)下BRP細(xì)胞內(nèi)β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-1(β1，4G

3、alactosyltransferase-1，GalT-1)表達(dá)的改變情況；流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry， FCM)觀察高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡情況。3．高糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)：RT-PCR、細(xì)胞蛋白凝集素染色、細(xì)胞免疫組化(凝集素染色)觀察HUVEC細(xì)胞內(nèi)GaIT-1的表達(dá)情況；采用RNA干擾(RNA interference，RNAi

4、)技術(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)源性GaIT-1的表達(dá)，F(xiàn)CM觀察細(xì)胞凋亡情況，蛋白免疫印跡(Western blot)觀察cleave Caspase-3的表達(dá)；含GaIT-1啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，高糖以及高糖+SP1抑制劑共培養(yǎng)細(xì)胞，雙熒光素酶測(cè)定法觀察GalT-1的轉(zhuǎn)錄活性。4．高糖培養(yǎng)牛視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Bovine Retinal Endothelial Cell,BREC)，采用衣霉素(tunicamycin)干擾細(xì)胞N-糖基化修飾，R

5、T-PCR、Westernblot分別檢測(cè)BREC細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1)在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，F(xiàn)CM觀察細(xì)胞膜表面ICAM-1分子的表達(dá)；免疫共沉淀(Immunoprecipitation，IP)結(jié)合凝集素染色觀察高糖培養(yǎng)下ICAM-1分子N-糖基化修飾的變化。 結(jié)果：1．糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織GalT-1 mRNA表達(dá)上調(diào)；糖尿病大鼠視網(wǎng)

6、膜組織蛋白由Galβ1→4GlcNAc基團(tuán)參與的糖基化修飾上調(diào)；視網(wǎng)膜組織蛋白N-糖基化修飾上調(diào)。2．高糖培養(yǎng)環(huán)境下，BRP細(xì)胞內(nèi)GaIT-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，由Galβ1→4GlcNAc基團(tuán)參與的蛋白糖基化修飾上調(diào)；高糖培養(yǎng)下，BRP細(xì)胞凋亡加?。? mM葡萄糖組：7.35±1.82％；10 mM葡萄糖組：16.34±2.25％；20 mM葡萄糖組：29.85±6.66％；30 mM葡萄糖組：39.48±6.48％。3．高糖培養(yǎng)下，

7、HUVEC細(xì)胞內(nèi)GaIT-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，HUVEC細(xì)胞蛋白由Galβ 1→461cNAc基團(tuán)參與的糖基化修飾表達(dá)上調(diào)；抑制內(nèi)源性GalT-1的表達(dá)部分抑制了高糖所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和Caspase-3的活性；高糖培養(yǎng)上調(diào)SP1的表達(dá)，采用SP1抑制劑共培養(yǎng)HUVEC抑制了高糖所誘導(dǎo)的GalT-1轉(zhuǎn)錄活性的上調(diào)。4．高糖培養(yǎng)使BREC細(xì)胞ICAM-1分子在mRNA、蛋白水平以及細(xì)胞膜表面的表達(dá)均上調(diào)；ICAM-1表達(dá)的上調(diào)與I

8、CAM-1分子的N-糖基化水平改變一致；抑制細(xì)胞的N一糖基化修飾可抑制高糖所誘導(dǎo)的BREC細(xì)胞膜表面ICAM-1分子表達(dá)的上調(diào)。 結(jié)論：1．糖尿病狀態(tài)下，大鼠視網(wǎng)膜組織中GalT-1及其介導(dǎo)的酶促糖基化反應(yīng)上調(diào)。2．高糖培養(yǎng)下，BRP細(xì)胞內(nèi)GalT-1的表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)的上調(diào)可能參與了高糖誘導(dǎo)的BRP細(xì)胞的凋亡。3．高糖培養(yǎng)下，HLJVEC細(xì)胞內(nèi)GalT-1的表達(dá)上調(diào)，高糖通過上調(diào)SP1的表達(dá)，上調(diào)GalT-1的表達(dá)；GalT-