耐輻射奇球菌特種類胡蘿卜素deinoxanthin藥理學(xué)活性的初步研究.pdf

1、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans，DR)對(duì)電離輻射、紫外線、干燥等一系列DNA損傷劑表現(xiàn)出強(qiáng)耐受力而著稱，是地球上已知的輻射抗性最強(qiáng)的生物之一。耐輻射奇球菌體內(nèi)能夠大量合成類胡蘿卜素。類胡蘿卜素一般是從植物中提取，人們認(rèn)為類胡蘿卜素能夠維持身體健康，防止疾病。其可能機(jī)制為抗氧化作用、基因調(diào)控、細(xì)胞增殖調(diào)控、免疫調(diào)控、藥理代謝酶活性的調(diào)控等。Deinoxanthin是耐輻射奇球菌特有的主要類胡蘿卜素產(chǎn)物，含有1

2、3個(gè)共軛雙鍵，在C2和C1’位各含一個(gè)羥基，而較長(zhǎng)的共軛雙鍵系統(tǒng)和活性基團(tuán)取代被認(rèn)為對(duì)類胡蘿卜素清除自由基能力有重大貢獻(xiàn)。已有的研究證明這種特殊結(jié)構(gòu)的類胡蘿卜素比其他類胡蘿卜素包括番茄紅素(lycopene)和β-胡蘿卜素等(β-carotene)有更高的自由基清除能力，而且其清除效果與其濃度呈正比。由輻射水解產(chǎn)生的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)是導(dǎo)致DNA損傷的重要因素。耐輻射奇球菌的ROS清除

3、體系包括兩個(gè)方面：抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)。Deinoxanthin作為DR菌非酶類抗氧化系統(tǒng)中的一種特殊天然化合物，能有效地清除活性氧自由基，在菌體的抗氧化作用中發(fā)揮著重要作用，它是耐輻射奇球菌極端抗性機(jī)制中的重要因素之一。
　　 至今尚缺乏對(duì)Deinoxanthin藥理學(xué)活性的研究，本文主要對(duì)耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)物進(jìn)行了分離提取和藥理學(xué)活性的初步研究。研究結(jié)果如下：
　　 1.對(duì)耐輻射奇球菌類胡蘿卜素產(chǎn)物進(jìn)行了分離

4、提取，研究了deinoxanthin的有效溶劑載體系統(tǒng)，并以此載體研究deinoxanthin對(duì)人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780的藥理學(xué)作用。通過(guò)研究四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)和小牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)兩種溶劑系統(tǒng)對(duì)deinoxanthin細(xì)胞吸收量的影響，發(fā)現(xiàn)以FBS(稀釋倍數(shù)為10)為溶劑時(shí)，能夠保持deinoxanthin的穩(wěn)定性，并能夠提高類胡蘿卜素在人卵巢癌細(xì)胞A2780胞內(nèi)的吸

5、收量，12h時(shí)差異顯著。同時(shí)，deinoxanthin具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的生物學(xué)活性，在濃度大于1μmol/L時(shí)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。在提高其對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性方面，兩種不同的溶劑系統(tǒng)在表現(xiàn)deinoxanthin對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制能力上有顯著差異，F(xiàn)BS溶劑系統(tǒng)更適合用于研究deinoxanthin對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖影響。這在耐輻射奇球菌類胡蘿卜素的研究中尚屬首次，將促進(jìn)特殊類胡蘿卜素deinoxanthin藥理活性的應(yīng)用研究。
　　 2

6、.我們使用DPPH法分析發(fā)現(xiàn)，耐輻射奇球菌類胡蘿卜素能高效清除自由基DPPH。利用已構(gòu)建的R1△CrtB，由于CrtB的缺失，導(dǎo)致類胡蘿卜素合成受阻，通過(guò)H2O2處理后，突變株細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)氧化損傷水平明顯高于野生型。此結(jié)果說(shuō)明，相對(duì)野生型來(lái)說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)缺乏類胡蘿卜素將導(dǎo)致蛋白質(zhì)對(duì)氧化損傷更敏感。為了進(jìn)一步探究耐輻射奇球菌類胡蘿卜素對(duì)蛋白質(zhì)氧化的影響，我們使用體外檢測(cè)系統(tǒng)，研究了加入deinoxathin與否情況下蛋白質(zhì)氧化損傷情況，結(jié)果表

7、明，deinoxathin對(duì)蛋白質(zhì)氧化損傷的抑制能力增強(qiáng)，呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)。
　　 3.構(gòu)建了耐輻射奇球菌類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的高效表達(dá)載體pET28I、pUC19-sdY和pUC19-OsdY，實(shí)現(xiàn)了DR菌CrtI，CrtY和CrtO基因轉(zhuǎn)基因大腸桿菌，完成了轉(zhuǎn)基因菌株對(duì)不同酸堿度(pH)、培養(yǎng)基(碳源、氮源、鹽)等發(fā)酵條件參數(shù)的考察分析。
　　 綜上所述，耐輻射奇球菌類胡蘿卜素能夠有效保護(hù)蛋白免受氧化脅迫壓力，可能