立體定向血腫抽吸術(shù)對實驗性腦出血細(xì)胞凋亡影響的研究.pdf

1、本文采用IV型膠原酶注入建立腦出血動物模型，TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL．)及凋亡相關(guān)蛋白的檢測探討實驗性腦出血血腫周邊組織的凋亡損傷，并分析腦出血后TUNEL陽性細(xì)胞、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的時相變化規(guī)律，以及凋亡傳導(dǎo)信號Cytc、Fas的時程變化，并在早期實施大鼠腦內(nèi)立體定向血腫抽吸，減少血腫壓迫，通過探討治療前后腦出血灶周圍腦組織中細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律，全文分為三部分： 第一部

2、分：實驗性腦出血抽吸術(shù)的建立與評估 研究目的：在實驗性腦出血模型基礎(chǔ)上建立一種簡單經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性好、能模擬臨床過程的立體定向血腫抽吸術(shù)并對其效果進(jìn)行評估，可為進(jìn)一步研究早期立體定向血腫清除術(shù)后腦組織的病理生理變化提供理想的方法。 實驗材料與方法： 66只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重180-220g，月齡3～5月)隨機(jī)分為4組：正常組(n=12只)、假手術(shù)組(n=18只)、腦出血對照組(n=

3、18只)、腦出血后血腫抽吸組(n=18只)。腦出血對照組將Ⅳ型膠原酶注入SD大鼠尾狀核誘導(dǎo)形成腦出血后對其不進(jìn)形任何處置。假手術(shù)組過程同腦出血對照組只是不向大鼠腦內(nèi)注射膠原酶，腦出血后血腫抽吸組將Ⅳ型膠原酶注入SD大鼠尾狀核誘導(dǎo)形成腦出血10個h后向血腫腔內(nèi)注入尿激酶溶解血凝塊，實施血腫抽吸術(shù)排出腦內(nèi)血腫。通過t檢驗對血腫抽吸組與未抽吸組及假手術(shù)組之間腦血腫體積、腦組織含水量的測定及行為學(xué)評分對立體定向血腫抽吸術(shù)的效果進(jìn)行評估。

4、 實驗結(jié)果： 1．腦出血抽吸組血腫體積小于腦出血組(P<0.01)； 2．抽吸組和腦出血組的腦組織含水量沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)； 3．腦出血抽吸后第3d、7d組的神經(jīng)功能恢復(fù)優(yōu)于對照組(P<0.05)。 第二部分：血腫抽吸術(shù)對大鼠腦出血細(xì)胞凋亡基因表達(dá)的影響。 研究目的：對大鼠腦出血模型應(yīng)用立體定向血腫抽吸術(shù)，通過凋亡細(xì)胞及凋亡基因表達(dá)產(chǎn)物Bcl-2，Bax，Caspase-3陽性細(xì)胞的計

5、數(shù)變化，探討早期立體定向血腫抽吸術(shù)對于腦出血后抑制細(xì)胞凋亡是否有積極的作用。 實驗材料和方法： 1．實驗動物和分組：選用健康雄性SD大鼠150只，體重180～220g，鼠齡3～5月，隨機(jī)大鼠隨機(jī)分成6組，第1組為正常對照組，第2組為假手術(shù)6h、12h、1d、3d、7d、11d組，第3組為腦出血自然恢復(fù)6h、12h、1d、3d、7d、11d組，第4組為6h血腫抽吸12h、1d、3d、7d、11d組，第5組為12h血腫抽吸1

6、d、3d、7d、11d組，第6組為1d血腫抽吸3d、7d、11d組。每組每時相點動物6只。 2．實驗器材和試劑： KOPF型大鼠腦立體定位儀(美國KOPF公司)微量注射器微量分析天平TUNEL試劑盒(Promega公司)免疫組化試劑盒兔抗大鼠Caspase-3(Lab Vision公司提供)兔抗大鼠Bax(天津灝洋公司提供)兔抗大鼠Bcl-2(天津灝洋公司提供)。 3．實驗方法：(1)模型建立后6h、12h、1d

7、、3d、7d、11 d處死，應(yīng)用TUNEL技術(shù)以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bax和Bcl-2的免疫組化檢測等方法，檢測大鼠ICH后不同時相點血腫周邊的細(xì)胞凋亡情況，并分析ICH后細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律；(2)分別在注入Ⅳ型膠原酶后6h，12h，1d進(jìn)行血腫抽吸術(shù)，于1d，3d，7d檢測TUNEL陽性細(xì)胞及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，Bax和Bcl-2的表達(dá)。 4．統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間比較采用t檢驗。P

8、<0.05，有顯著差異。以SPSS10.O進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 實驗結(jié)果 1．TIJNEL改變TUNEL陽性細(xì)胞在6h出現(xiàn)(16.3±2.4)，12hTUNEL陽性細(xì)胞開始增多(24.33±2.5)，1d繼續(xù)增多(60.31±8.96，P<0.05)，3d達(dá)到高峰(104.41±21.45，P<0.05)，7d至11 d陽性細(xì)胞在(65.12±18.94和35.17±2.87，P<0.05)水平。抽吸組TUNEL陽性細(xì)胞從注

9、入膠原酶后1d，3d，7d與自然恢復(fù)組比較均有明顯減少(1d：30.12±18.94，P<0.05；3d：60.41±21.45，P<0.05；7d：32.31±8.96，P<0.05)。 2．Caspase-3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果大鼠腦出血后6h基底節(jié)區(qū)出現(xiàn)Caspase-3蛋白的表達(dá)(2.86±2.44，P<0.05)，12h升高(20.75±5.21，P<0.05)，1 d(60.15±2.15，P<0.05)達(dá)到高峰，在

10、3d(44.21±4.21，P<0.05)，7d，11d維持在(35.22±1.22，36.22±4.39，P<0.05)水平。 3．Bax免疫組化染色結(jié)果大鼠腦出血后6h基底節(jié)區(qū)出現(xiàn)Bax蛋白的表達(dá)(2.55±3.14，P<0.05)，12h升高(18.22±4.55，P<0.05)，1d(45.32±5.22，P<0.05)達(dá)到高峰，在3d(40.21±2.12，P<0.05)，7d，11d維持在(40.01±3.23，38

11、.21±2.33，P<0.05)水平。 4．Bcl-2免疫組化染色結(jié)果Bcl-2蛋白在膠原酶注入后6h，Bel-2的基因表達(dá)下降(43.22±2.37，P<0.05)，12h觀察，Bel-2的基因表達(dá)(45.22±2.02，P<0.05)，1d時Bcl-2的基因表達(dá)(42.13±2.11，P<0.05)，3d時基因表達(dá)為(37.13±2.15，P<0.05)，7d和11 d蛋白表達(dá)為(45.23±5.11，47.22±8.89，

12、P<0.05)。 抽吸組Bcl-2陽性細(xì)胞從注入膠原酶后1d，3d，7d與自然恢復(fù)組比較均有明顯增強(1d：67.21±9.25，P<0.05；3d：66.12±20.07，P<0.05；7d：70.22±4.21，P<0.05)。 第三部分：血腫抽吸術(shù)對大鼠腦出血細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的影響。 研究目的：旨在通過觀察大鼠腦出血大腦出血側(cè)紋狀體區(qū)細(xì)胞凋亡以及凋亡傳導(dǎo)信號Cytc、Fas的時程變化，探討早期微創(chuàng)治療對腦出

13、血后細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)的影響。 實驗材料和方法： 1．實驗動物：健康雄性SD大鼠78只(體重180-220g，鼠齡3～5月)，隨機(jī)分為4組：正常組(n=6只)、假手術(shù)組(n=6只)、腦出血對照組(n=36只)、血腫抽吸組(n=30只)。 2．實驗器材和試劑： kopf型大鼠腦立體定位儀(美國kopf公司)微量注射器TUNEL試劑盒(Promega公司)免疫組化試劑盒兔抗大鼠Caspase-3(Lab Vis

14、ion公司提供)鼠抗大鼠Cytc(Santa cruz公司提供)羊抗大鼠Fas(TD公司提供)。 3．實驗方法：(1)模型建立后6h、12h、1d、3d、7d、11d處死，應(yīng)用TUNEL技術(shù)以及凋亡傳導(dǎo)信號相關(guān)蛋白Cytc、Fas的免疫組化檢測等方法，檢測大鼠ICH后不同時相點血腫周邊的細(xì)胞凋亡情況，并分析ICH后細(xì)胞凋亡的變化規(guī)律；(2)在注入Ⅳ型膠原酶后6h進(jìn)行血腫抽吸術(shù)，于6h，12h，1d，3d，7d，11d，檢測TUN

15、EL陽性細(xì)胞及凋亡傳導(dǎo)信號相關(guān)蛋白Cytc、Fas的表達(dá)。 4．統(tǒng)計學(xué)分析：結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)間比較采用進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，P<0.05表示差異有顯著性。 實驗結(jié)果： 1．腦出血組各時間點細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯高于對照組和假手術(shù)組，差異有顯著性P<0.05，1d～11 d的細(xì)胞凋亡數(shù)明顯高于血腫抽吸組，差異有顯著性P<0.05。 2．自然恢復(fù)組出血側(cè)大腦紋狀體區(qū)Cytc、Fas表達(dá)高峰在3～7d出

16、現(xiàn)；血腫抽吸組在時間點12h～7d Cytc的表達(dá)及3d Fas的表達(dá)明顯低于自然恢復(fù)組，差異有顯著性P<0.05。 在細(xì)胞凋亡的發(fā)生發(fā)展過程中，主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有兩條：一為死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：Fas-FasL系統(tǒng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)，F(xiàn)as-FasL-系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)為PCD機(jī)制增加了新的認(rèn)識，使以往對PCD胞漿及核內(nèi)事件的認(rèn)識與膜信號傳導(dǎo)機(jī)制聯(lián)系起來。已有研究表明，某些細(xì)胞在其發(fā)生發(fā)展過程中Fas的表達(dá)不斷增加，而凋亡抑制基因

17、．Bcl-2的表達(dá)逐漸減少，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，完成細(xì)胞代謝過程，達(dá)到細(xì)胞增殖與死亡的平衡?？梢娂?xì)胞凋亡不僅受細(xì)胞本身的ced-3、Bcl-2等的控制，還受Fas-FasL系統(tǒng)的調(diào)控。細(xì)胞膜表面表達(dá)有可能的Fas蛋白，并且其表達(dá)量達(dá)到一定程度是通過Fas-FasL途徑誘導(dǎo)凋亡作用的首要條件；二為線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：Cytc在dATP存在的情況下，與Apaf-1結(jié)合，使Apaf-1暴露其上的CARD(caspase activatio