G250膜外段基因的克隆表達(dá)及其核酸疫苗免疫效應(yīng)的初步觀察.pdf

1、本文研究目的：構(gòu)建G250抗原蛋白膜外段的真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)-G250，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞表達(dá)目的蛋白，為G250的相關(guān)后續(xù)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)；同時(shí)將表達(dá)重組體作為核酸疫苗免疫小鼠，觀察體液應(yīng)答效果，為制備G250單抗及其基因疫苗的研究提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 研究方法：從腎癌組織終提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GeneBank上G250序列(AJ010588)設(shè)計(jì)一對(duì)含XbaⅠ位點(diǎn)、Hind

2、Ⅲ位點(diǎn)的引物，PCR擴(kuò)增G250抗原基因的膜外目的片段。PCR產(chǎn)物和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)分別經(jīng)雙酶切后凝膠回收純化，用T4酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。從氨芐青霉素陽(yáng)性的LB板上隨機(jī)挑取單菌落，增菌并提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，含有目的片段的為陽(yáng)性重組子，采用自動(dòng)序列分析儀對(duì)插入片段進(jìn)行序列分析。 采用無(wú)菌操作提取并純化G250-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入小鼠卵巢癌上皮細(xì)胞CHO

3、細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用G418600ug/ml選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)G418抗性克隆用RT-PCR方法篩選鑒定陽(yáng)性克隆，并擴(kuò)大培養(yǎng)之。獲得穩(wěn)定生長(zhǎng)并表達(dá)G250目的蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞株，用間接免疫熒光法檢測(cè)表達(dá)的G250膜外段蛋白在細(xì)胞中的位置。提取細(xì)胞總蛋白，用Western-Blotting法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)G250膜外段蛋白的分子量。 大量提取并純化G250-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，作為核酸疫苗注射入小鼠的后肢腓腸肌，進(jìn)行核酸

4、免疫。免疫4次后的小鼠血清作為一抗，腎癌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株786-0做抗原細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光法檢測(cè)。以此觀察核酸免疫的體液免疫效果。 研究結(jié)果：從腎癌組織終提取總RNA經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，用1.0％瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)一條特異條帶，位置在750bp和1000bp之間，其大小與預(yù)計(jì)片段大小基本一致，而陰性對(duì)照未見(jiàn)任何條帶。陽(yáng)性重組子經(jīng)PCR擴(kuò)增后瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)目的條帶，經(jīng)雙酶切后顯示目的條帶和5.4KB的pcDNA3.1(+)條帶。

5、序列測(cè)定結(jié)果與GeneBank上G250序列(AJ010588)進(jìn)行Blast分析，相應(yīng)片段的同源性為100％。 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入小鼠卵巢癌上皮細(xì)胞CHO細(xì)胞，經(jīng)篩選和鑒定得到兩株穩(wěn)定表達(dá)G250膜外片段的陽(yáng)性轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，經(jīng)RT-PCR證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)存在G250膜外段的mRNA轉(zhuǎn)錄，間接免疫熒光法檢測(cè)到轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)G250膜外段在CHO的細(xì)胞膜上。Western-Blotting法證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)蛋白的分子量約為

6、32KD，與預(yù)計(jì)相符。 將重組質(zhì)粒作為DNA疫苗免疫小鼠，取小鼠免疫血清，用腎癌標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株786-0做間接免疫熒光法檢測(cè)，結(jié)果呈陽(yáng)性。且抗體稀釋度可達(dá)1∶10。 研究結(jié)論： 1、利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了G250膜外段編碼區(qū)cDNA,經(jīng)序列分析顯示擴(kuò)增的序列正確。 2、構(gòu)建了G250膜外段真核表達(dá)載體，并建立了穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。表達(dá)的目的蛋白為G250抗原后續(xù)的相關(guān)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。