AT1R，AT2R和ERK1在大鼠主動脈損傷中的表達(dá)及與內(nèi)膜增生的關(guān)系.pdf

1、【目的】 經(jīng)皮腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTA)和血管移植術(shù)后再狹窄(RS)至今仍是一個未找到答案的“謎”。多種血管成形術(shù)新技術(shù)，如動脈粥樣斑塊切除術(shù)、激光成形術(shù)、血管內(nèi)支架、超聲血管成形術(shù)，特別是藥物洗脫支架的應(yīng)用及基因治療，使防止RS取得了巨大進(jìn)展，使其發(fā)生率明顯降低，但由于存在“邊緣效應(yīng)”且RS發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，防治RS的任務(wù)仍很艱巨。目前認(rèn)為，早期動脈段的彈性回縮、血管平滑肌細(xì)胞(vSMC)遷移與增殖、新生內(nèi)膜增生、細(xì)胞外基質(zhì)合成、管

2、壁重塑被認(rèn)為是術(shù)后RS的重要因素。與RS相關(guān)的基因研究成為當(dāng)前血管外科研究的熱點、難點。 新生內(nèi)膜增生是RS發(fā)生的突出病理改變。因此對新生內(nèi)膜增生的發(fā)生機(jī)制及防治研究將有可能成為攻破RS的突破口，篩選出與RS相關(guān)的基因，有望成為解決該難題的手段之一。血管損傷引發(fā)了VSMC的表型轉(zhuǎn)化，使處于靜止?fàn)顟B(tài)的VSMC由收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣杀硇?，重新獲得增殖和遷移能力，突破內(nèi)彈力膜從血管中膜進(jìn)入內(nèi)膜并在內(nèi)膜中大量增殖，同時分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，

3、促進(jìn)新生內(nèi)膜形成。人體局部組織(包括血管、腦、心、腎等)存在的腎素．血管緊張素系統(tǒng)參與了血管損傷后新生內(nèi)膜增生及RS的過程。其通過分泌血管緊張素調(diào)節(jié)血管細(xì)胞的生長，并在調(diào)節(jié)肌性內(nèi)膜對血管壁損傷所發(fā)生的增生反應(yīng)方面起重要作用。血管中膜VSMC有大量特異AngⅡ受體。由于AngⅡ在促進(jìn)生長因子增生方面起重要作用，因此推測減少或阻斷一種或多種受體可能對預(yù)防術(shù)后RS有一定的作用。研究表明，AngⅡ 1型受體(ATlR)介導(dǎo)了AngⅡ的促進(jìn)VSM

4、C增殖、遷移、抑制凋亡的作用；Ang Ⅱ2型受體(AT2R)則具有拮抗．ATlR的作用，從而推測AT2R介導(dǎo)了抑制新生內(nèi)膜增生的作用。AT2R在胚胎組織中含量豐富，出生后表達(dá)迅速下降。在血管損傷、炎癥、自發(fā)性高血壓病理條件下，血管局部AT2R重新表達(dá)，提示AT2R可能參與了血管損傷后的結(jié)構(gòu)重塑過程。 雖然有報道示，AT2R可抑制AT1R激活的胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK(或稱p42和p44MAPK)信號通路，下調(diào)VSMC中ATlR的表

5、達(dá)，抑制細(xì)胞增殖及胞外基質(zhì)合成，但關(guān)于AT2R的功能研究多在細(xì)胞培養(yǎng)及基因敲除水平，而在成年動物病理狀態(tài)下，尤其是在新生內(nèi)膜形成過程中局部組織．AT2R的功能及其與AT1R的相互作用關(guān)系研究領(lǐng)域極少有報道。關(guān)于AT2R在動物水平究竟發(fā)揮怎樣的作用?是抑制還是促進(jìn)RS的發(fā)生?其詳盡作用機(jī)制又如何等問題尚不明確。AT2R基因能否應(yīng)用于RS的治療也值得探討。本實驗在動物水平應(yīng)用相應(yīng)的阻斷劑分別或聯(lián)合阻斷AT1R、AT2R和ERK1在mRNA及

6、蛋白水平的表達(dá)，分析其表達(dá)與內(nèi)膜增生之間的關(guān)系，探討ATlR和AT2R的相互作用關(guān)系，為治療新生內(nèi)膜增生尋找新的靶點。 【方法】 建立大鼠主動脈球囊損傷模型，利用相應(yīng)的受體阻斷劑纈沙坦(Valsartan)、PD123319和PD98059分別阻斷ATlR、AT2R和ERK1，于術(shù)后7d、14d、21d三個時相點進(jìn)行病理切片，觀察AT1R、AT2R和ERK1對新生內(nèi)膜增生的影響；利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和蛋

7、白免疫印跡雜交(Westernblotting)技術(shù)檢測AT1R、AT2R和ERK1 mRNA和蛋白在血管中表達(dá)變化，觀察AT1R和AT2R兩型受體之間表達(dá)存在的相互作用關(guān)系及它們對ERK1的影響。 【結(jié)果】 1．成功制作大鼠主動脈球囊損傷模型。 2．球囊損傷7d后可見新生內(nèi)膜增生，14d增生達(dá)頂峰，到2ld基本趨于穩(wěn)定(P<0.01)。使用PDl23319后對新生內(nèi)膜增生無影響，與單純損傷組比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>

8、0.05)。應(yīng)用Valsaxtan或PD98059或兩者聯(lián)合應(yīng)用后，血管新生內(nèi)膜增生現(xiàn)象明顯減輕，新生內(nèi)膜面積(IA)和新生內(nèi)膜面積/中膜面積(IA/MA)減小，抑制作用以14d最顯著，與正常對照組、單純損傷組和PD123319組比，P<0.01。但三組間新生內(nèi)膜增生程度在三個時相點仍顯著高于正常對照組，P<0.01。Valsartan或PD98059或兩者聯(lián)合應(yīng)用后，三組間抑制新生內(nèi)膜增生無明顯差別(P>0.05)。 3．正常

9、對照組血管壁中可見AT1R mRNA和蛋白表達(dá)。球囊損傷后，單純損傷組、PD123319組和PD98059組AT1R mRNA和蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，并在14d達(dá)高峰，21d逐漸降低并恢復(fù)至7d水平，與正常對照組比有顯著性差異(P<0.01)，但三組間 ATlR mRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Val組和Val+PD98059組可明顯抑制3個時相點AT1R mRNA和蛋白表達(dá)，與單純損傷組、PD123319組和PD980

10、59組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，但兩組問AT1RmRNA和蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O．05)。經(jīng)PD123319阻斷AT2R后，AT1RmRNA和蛋白表達(dá)量與單純損傷組相比無明顯差異(p>0.05)。 4．正常對照組血管壁中未見AT2R mRNA和蛋白表達(dá)。球囊損傷后7d可見少量AT2RmRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)，在14d達(dá)到高峰(P<0.01)，21d時AT2RmRNA和蛋白表達(dá)下降。PD123319

11、組AT2R mRNA和蛋白明顯下降，與其他四組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)。Val組、PD98059組及Val+PD98059組AT2R mRNA和蛋白表達(dá)與單純損傷組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，三組間兩者的表達(dá)也無顯著性差異(p>0.05)。經(jīng)Valsartan阻斷ATlR后，AT2R mRNA和蛋白表達(dá)量與單純損傷組相比無明顯差異(p>0.05)。 5．正常對照組血管壁中可見ERK1 mRNA和蛋白表達(dá)，球囊損傷后7d表達(dá)

12、明顯增強(qiáng)(P<0.01)，隨損傷時間延長ERK1 mRNA和蛋白表達(dá)量逐漸下降，至21d表達(dá)最弱(P0.05)，與Val、PD98059及Val+PD98059組相比，在7d及14d差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但21d差異無顯著性(p>0.05)。Val、PD98059及Val+PD98059組與正常對照組比較，在7d差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但14d和2

13、1d差異無統(tǒng)計學(xué)意義，該三組間在各時相點中相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>O．05)。 【結(jié)論】 1．成功建立大鼠主動脈球囊損傷模型。 2．PD98059可抑制大鼠主動脈球囊損傷術(shù)后內(nèi)膜增生。Valsartan與PD98059兩者合用并未能增強(qiáng)其抑制內(nèi)膜增生的作用，考慮可能兩者作用于同一信號傳導(dǎo)通路。 3．AT1R促進(jìn)球囊損傷術(shù)后內(nèi)膜增生，AT2R則抑制球囊損傷術(shù)后內(nèi)膜增生。在抑制內(nèi)膜增生過程中，AT1R和