SELEX技術篩選人TGF-βRⅡ親和核酸庫方法的建立.pdf

1、第三軍醫(yī)大學碩士學位論文SELEX技術篩選人TGFβRⅡ親和核酸庫方法的建立姓名：劉曉靜申請學位級別：碩士專業(yè)：外科學（野戰(zhàn)外）指導教師：朱旭東20040501第三軍醫(yī)大學碩士學位論文7為1.21015。靶蛋白TGFβRⅡ與ssDNA0溫育后，反應混合液上樣到硝酸纖維素膜上，真空抽濾，洗脫游離核酸。7M尿素、酚氯仿回收膜上滯留的ssDNA。行PCR擴增時，采用5′端生物素化的下游引物，使PCR產物偶聯上生物素。變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化

2、PCR產物。利用StreptavidinAgarose捕獲dsDNA，0.15N的NaOH使雙鏈變性，釋放非生物素標記的ssDNA，回收后用于第2輪篩選。2)第2～4輪篩選：將靶蛋白TGFβRⅡ預先吸附到固相基質PhenylAgarose上，然后與ssDNA富集庫溫育，洗脫未結合核酸，回收與TGFβRⅡ結合的ssDNA。擴增、富集、分離目的ssDNA步驟同前。從第3輪篩選始，引入針對固相基質PhenylAgarose的反向篩選。3)第5

3、～8輪篩選：與第3～4輪篩選相比，做兩點調整：(1)反向篩選調整為：富集庫與預先吸附了BSA的固相基質PhenylAgarose溫育。(2)篩選時，向篩選緩沖體系中加入酵母tRNA。隨著篩選的進行，嚴謹度不斷增加。3.監(jiān)測富集庫進化狀態(tài)1)膜結合測定實驗：將32P放射性標記的初始庫、富集庫分別與TGFβRⅡ及BSA溫育，反應混合液上樣到硝酸纖維素膜上，負壓抽濾，空氣中干燥濾膜。液閃儀計數CPM值。以百分值〔(核酸蛋白組膜上放射殘留量－單

4、純核酸組膜上放射殘留量)投入反應核酸的放射總量〕100％估算核酸庫對靶蛋白的親和程度。2)凝膠遷移阻滯實驗：將32P放射性標記的初始庫、富集庫分別與TGFβRⅡ及BSA溫育，反應混合液上樣到4％非變性聚丙烯酰胺凝膠中，電泳，放射自顯影。結果：第8輪富集庫對靶蛋白TGFβRⅡ的親和力較初始隨機庫提高了22.61倍，有非常顯著的差異(P0.01)。在第8輪富集庫＋TGFβRⅡ組泳道中觀察到核酸蛋白復合物滯后帶。同時，雖然第8輪富集庫對BSA