代謝因子對(duì)胰島和下丘腦內(nèi)分泌相關(guān)電生理反應(yīng)的影響.pdf

1、內(nèi)分泌細(xì)胞及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一類主要可興奮性細(xì)胞，其生理功能為分泌相關(guān)激素或神經(jīng)遞質(zhì)。各種類型分泌細(xì)胞在接受刺激產(chǎn)生分泌活動(dòng)前，均表現(xiàn)出膜電位、電阻等一系列電信號(hào)的改變。因此，揭示分泌細(xì)胞電生理特性的研究對(duì)于探討其細(xì)胞內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制顯得尤為重要。機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)受多種代謝因子的調(diào)節(jié)，如碳水化合物，氨基酸及脂肪酸以及多種代謝相關(guān)因子（如Leptin，Adiponectin，Ghrelin，Obestatin）等。為探討

2、機(jī)體代謝相關(guān)因子對(duì)內(nèi)分泌及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞電生理特性和分泌活動(dòng)的影響，本研究選擇經(jīng)典內(nèi)分泌細(xì)胞胰腺β細(xì)胞為代表，研究了物質(zhì)代謝中脂肪酸對(duì)細(xì)胞電生理特性及分泌功能的影響，探討脂肪酸直接影響β細(xì)胞的機(jī)制；選擇經(jīng)典生長(zhǎng)軸的生長(zhǎng)激素細(xì)胞，研究了新近發(fā)現(xiàn)的胃腸激素Ghrelin及Obestatin對(duì)生長(zhǎng)素細(xì)胞的上層調(diào)控神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞--GHRH神經(jīng)元的電生理特性及其功能的影響，探討機(jī)體代謝因子Ghrlein對(duì)生長(zhǎng)激素分泌的間接調(diào)控的機(jī)制。

3、本文共分為三章。在第1章和2章，采用原代培養(yǎng)的大鼠胰腺β細(xì)胞，研究了脂肪酸對(duì)胰腺β細(xì)胞電生理特性的影響及其機(jī)制。第3章采用eGFP-GHRH轉(zhuǎn)基因小鼠，在新鮮制備的下丘腦腦片上檢測(cè)Ghrelin及Obestatin對(duì)小鼠GHRH細(xì)胞在完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中突觸反應(yīng)的影響。 第一章長(zhǎng)鏈脂肪酸對(duì)大鼠胰腺β細(xì)胞上電壓依賴性鉀電流的影響1.采用制霉菌素穿孔的全細(xì)胞電流記錄方法，檢測(cè)到長(zhǎng)鏈脂肪酸可顯著性減小IK電流，并引起此電流的快速失活，另外，

4、時(shí)間曲線顯示此效應(yīng)為可逆性。 2.采用RT-PCR方法檢測(cè)到GPR40mRNA在大鼠胰島組織、MIN6小鼠β細(xì)胞株和INS-1大鼠β細(xì)胞株上均有高水平GPR40mRNA的表達(dá)。 3.采用GPR40特異性siRNA下調(diào)MIN6細(xì)胞GPR40mRNA的表達(dá)后，細(xì)胞的電壓依賴性鉀電流無(wú)明顯改變，但亞油酸誘導(dǎo)的電壓依賴性鉀電流降低效應(yīng)則被顯著抑制。給予受體后分子信號(hào)的激動(dòng)劑，即膜通透性cAMP的激動(dòng)劑，8-bromo-cAMP，

5、在正常MIN6細(xì)胞和siRNA-GPR40處理后MIN6細(xì)胞上，均可觀察到類似亞油酸誘導(dǎo)的鉀電流抑制效應(yīng)。 4.ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，亞油酸呈濃度依賴性增加MIN6β細(xì)胞株胰島素的分泌。而相同濃度的甲基亞油酸鹽并不影響胰島素分泌及亞油酸的促胰島素分泌效應(yīng)。 結(jié)論：①亞油酸通過(guò)與細(xì)胞膜上GPR40受體結(jié)合，顯著降低大鼠胰腺β細(xì)胞上電壓依賴性鉀電流并加快其失活。②亞油酸的快速效應(yīng)可引起胰腺β細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增高，胰島素釋放

6、顯著增加。 第二章亞油酸對(duì)大鼠胰腺β細(xì)胞上電壓依賴性鈣電流的影響1.制霉菌素穿孔全細(xì)胞電流記錄法，記錄體外原代培養(yǎng)大鼠胰腺β細(xì)胞上VDCC電流，細(xì)胞外液中加入亞油酸可逆性引起VDCC電流的顯著降低。 2.與GPR40無(wú)結(jié)合效應(yīng)的甲基亞油酸鹽對(duì)大鼠胰腺β細(xì)胞VDCC電流無(wú)任何影響，而在此基礎(chǔ)上，再給予亞油酸，可觀察到同樣的VDCC電流降低。 3.亞油酸降低胰腺β細(xì)胞上VDCC電流的信號(hào)傳導(dǎo)途徑研究顯示，PKC和PK

7、A阻斷劑的存在并不影響大鼠胰腺β細(xì)胞上的VDCC電流以及亞油酸降低鈣電流的效應(yīng)。Thapsigargin預(yù)培養(yǎng)30分鐘，可阻斷亞油酸誘導(dǎo)的細(xì)胞膜上VDCC電流的改變。 4.[Ca2+]測(cè)定試驗(yàn)顯示，β細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的基礎(chǔ)水平不受Thapsigargin的影響；亞油酸顯著增高[Ca2+]i，而甲基亞油酸并不影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變。 5.肪酸與GPR40結(jié)合，可激活細(xì)胞內(nèi)PLC-IP3途徑，繼而增加細(xì)胞內(nèi)鈣的釋放。采用PL

8、C阻斷劑U73122可完全阻斷亞油酸降低β細(xì)胞VDCC電流的效應(yīng)，同時(shí)，亞油酸在β細(xì)胞上引起的一過(guò)性[Ca2+]i增高也被完全消除。 結(jié)論：亞油酸刺激細(xì)胞內(nèi)鈣釋放，通過(guò)鈣誘導(dǎo)的VDCC失活顯著降低大鼠胰腺β細(xì)胞上電壓依賴性鈣電流。 第三章Ghrelin和Obestatin對(duì)GFP-GHRH轉(zhuǎn)基因小鼠GHRH神經(jīng)元Glutamatergic及GABAergic突觸反應(yīng)的影響1.Ghrelin及obestatin對(duì)GHRH神

9、經(jīng)元eEPSCs的影響，試驗(yàn)分別檢測(cè)了16和19個(gè)神經(jīng)元，結(jié)果顯示，1μMGhrelin和Obestatin均不影響GHRH神經(jīng)元上的eEPSCs。 2.Ghrelin對(duì)GHRH神經(jīng)元eIPSCs的影響，在記錄的49個(gè)細(xì)胞中，26個(gè)細(xì)胞（約53.06％）的eIPSCs在Ghrelin處理后，較對(duì)照電流明顯降低，余24個(gè)神經(jīng)元對(duì)Ghrelin并不敏感。另外，Ghrelin對(duì)eIPSCs的降低效應(yīng)呈劑量依賴性。 3.GHSR

10、-1A特異性拮抗劑BIM28163對(duì)eIPSCs無(wú)影響，但可完全阻斷Ghrelin對(duì)GHRH細(xì)胞eIPSCs的抑制效應(yīng)。 4.Obestatin不影響GHRH神經(jīng)元的eIPSCs，但可完全阻斷Ghrelin對(duì)GHRH細(xì)胞eIPSCs的抑制效應(yīng)。 5.為了排除GHRH神經(jīng)元本身對(duì)Ghrelin不敏感的可能性，也采用了先給予Ghrelin，然后Ghrelin與Obestatin聯(lián)合給藥的方式，在6個(gè)記錄的GHRH神經(jīng)元中，均

11、觀察到Obestatin對(duì)Ghrelin的拮抗效應(yīng)。另外，相同條件下Ghrelin雙次給藥均可引起GHRH神經(jīng)元上eIPSCs電流降低的結(jié)果用以排除受體失活導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果的可能性。 6.放射免疫法測(cè)定小鼠下丘腦腦片培養(yǎng)液中GHRH含量，Ghrlein對(duì)基礎(chǔ)水平GHRH的釋放無(wú)影響，但可在28mMKCl協(xié)同作用下刺激GHRH的釋放。 結(jié)論：①Ghrelin對(duì)GHRH細(xì)胞的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)突觸反應(yīng)無(wú)影響，但顯著降低GHRH細(xì)胞

12、對(duì)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的突觸反應(yīng)，提示Ghrelin可參與調(diào)節(jié)GHRH神經(jīng)元興奮性的增加；②Obestatin阻斷Ghrelin對(duì)GHRH神經(jīng)元eIPSCs的抑制效應(yīng)提示Obestatin阻斷Ghrelin促GH分泌的機(jī)制發(fā)生在下丘腦水平；③Ghrlein對(duì)基礎(chǔ)水平GHRH的釋放無(wú)影響，但在KCl協(xié)同作用下刺激GHRH釋放，提示其在GHRH分泌釋放中的調(diào)節(jié)作用。 綜上所述，本研究首次闡明了長(zhǎng)鏈脂肪酸通過(guò)與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合，對(duì)胰腺