TMV侵染對(duì)煙草放氧復(fù)合體亞基表達(dá)的影響及轉(zhuǎn)psbO煙草的培育.pdf

1、放氧復(fù)合體(Oxygen-evolvingcomplex；OEC)是葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ的一個(gè)復(fù)合體，位于類囊體膜的腔內(nèi)側(cè)，是葉綠體光反應(yīng)過程中氧化水分子釋放出氧氣所不可缺少的。OEC是由三個(gè)已確定的表觀分子量為33kDa、23kDa和16kDa(編碼的基因分別為：psbO，psbP和psbQ)的多肽及一些還未確定的分子量更小的多肽組成。植物病毒學(xué)的新近研究結(jié)果表明OEC的多肽與病毒侵染后的癥狀表達(dá)有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)以本生煙(Nicotian

2、a.benzhamiana)為試材，采用RT-PCR方法，克隆了編碼OEC的三個(gè)主要多肽的cDNA核苷酸序列。其中，33kDa蛋白的cDNA序列與Genbank中登錄號(hào)為AY220076(編碼普通煙N.tabacum的OEC33kDa蛋白)的同源性最高，為98.76％，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為99.10％；23kDa蛋白的cDNA序列與Genbank中登錄號(hào)為X55354(編碼普通煙N.tabacum的OEC23kDa蛋白)的同源性最

3、高，為92.91％，cDNA的編碼序列同源性為97.07％，非同源的核苷酸主要位于3’端非翻譯區(qū)，推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為96.93％；16kDa蛋白的cDNA序列與Genbank中登錄號(hào)為AY568719(番茄中16kDa蛋白的cDNA序列)的序列同源性最高，為89.4％，推導(dǎo)的氨基酸序列也與AY568719編碼的序列同源性最高，為88.6％。同時(shí)也克隆了普通煙中16kDa蛋白的cDNA序列，與AY568719的同源性最高，為89.

4、7％，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為88.6％。從普通煙與本生煙葉片中測(cè)得的核苷酸序列與編碼的氨基酸序列之間的同源性分別為98.6％和99.6％(見圖2.10及2.11)。這是最先測(cè)得的煙草OEC16kDa蛋白亞基的cDNA序列。以上測(cè)得的序列已登錄到GenBank，獲得的序列號(hào)分別為AY952375，AY952374，AY887536(本生煙中33kDa，23kDa和16kDa的cDNA序列)和AY887537(普通煙中16kDa的cDNA

5、序列)。 將克隆到的OEC三種蛋白亞基的成熟肽的cDNA編碼區(qū)進(jìn)行亞克隆，與原核表達(dá)載體pET22b(+)連接。獲得的重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Westernblot分析表明，三種蛋白分別在大腸桿菌中得到了高效表達(dá)。采用金屬Ni2+螯合層析方法及切膠回收的方法將融合蛋白純化后免疫兔子，獲得了特異性較高的抗血清。ACP-ELISA方法測(cè)定效價(jià)分別為1/214，1/213和1/

6、214。 利用已制備的抗血清，測(cè)定了煙草花葉病毒侵染本生煙(N.benthamiana)和普通煙(N.tabacum)后上述三種蛋白的表達(dá)變化。煙草花葉病毒侵染本生煙表現(xiàn)癥狀為系統(tǒng)性葉片變小、向下卷曲，植株矮化，逐漸死亡；侵染普通煙(N.tabacum)表現(xiàn)出典型的系統(tǒng)性花葉癥狀。Westernblot分析結(jié)果表明，TMV侵染普通煙后，與對(duì)照相比，33kDa蛋白水平?jīng)]有顯著的變化，23kDa和16kDa蛋白水平顯著降低。TMV侵