精氨酸對蛋雞采食及組織蛋白質(zhì)代謝調(diào)控的機(jī)理研究.pdf

1、本論文研究飼糧添加精氨酸對蛋雞采食及相關(guān)因子、蛋白質(zhì)代謝調(diào)控的影響，并在建立雞胚腸上皮細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，研究精氨酸對雞胚腸上皮細(xì)胞精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)載體及蛋白質(zhì)合成與相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，精氨酸可影響蛋雞下丘腦（激素）和肝臟（脂肪酸氧化）中調(diào)控采食的相關(guān)蛋白表達(dá);研究揭示了精氨酸對蛋雞組織（肝臟和小腸）蛋白質(zhì)代謝相關(guān)調(diào)控因子基因表達(dá)規(guī)律;體外試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，精氨酸可以通過提高堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體-1和誘導(dǎo)性一氧化氮合酶基因

2、表達(dá)水平，增加外源精氨酸利用率及一氧化氮的生產(chǎn)量。研究結(jié)果，豐富了蛋雞采食理論，為功能性氨基酸在蛋禽組織蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控提供了依據(jù)。研究結(jié)果如下:
　　1蛋雞產(chǎn)蛋期精氨酸需要量的研究
　　本試驗(yàn)旨在研究國內(nèi)雜交品種蛋雞（新楊黑）產(chǎn)蛋期精氨酸的需要量。選取31周齡的新楊黑商品代蛋雞864只，隨機(jī)分為6組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)36只雞。蛋雞分別飼喂精氨酸水平為0.64％、0.86％、1.03％、1.27％、1.42％和1.66

3、％的玉米-玉米蛋白粉型飼糧。結(jié)果表明:隨著飼糧精氨酸水平的升高，采食量、日產(chǎn)蛋重、產(chǎn)蛋率及料蛋比的變化呈現(xiàn)顯著的二次效應(yīng)（P＜0.05）;1.27％精氨酸水平組的蛋白高度顯著高于其他各組(P＜0.05)?；诙吻€-折線回歸模型分析，結(jié)果提示:以采食量和日產(chǎn)蛋重為評判指標(biāo)，33-45周齡新楊黑蛋雞精氨酸需要量分別為1.26％和1.28％。
　　2精氨酸對蛋雞采食的調(diào)控研究
　　本試驗(yàn)在飼養(yǎng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究精氨酸對蛋雞下丘

4、腦NPY、瘦素、血清胃饑餓素、胰島素、一氧化氮含量的影響，同時利用同位素標(biāo)記相對與絕對定量技術(shù)檢測精氨酸對下丘腦和肝臟蛋白組分的影響。結(jié)果顯示:下丘腦NPY的含量在1.27％精氨酸組表現(xiàn)為最高（P＜0.05）;隨著精氨酸水平的增加，血清NO含量表現(xiàn)為升高的趨勢，1.27％精氨酸組胃饑餓素含量顯著低于其他各組(P＜0.05)。質(zhì)譜鑒定到的下丘腦蛋白共計3715個，0.64％精氨酸組與1.27％精氨酸組差異表達(dá)蛋白235個(P＜0.05);

5、質(zhì)譜鑒定到的肝臟蛋白共計3797個，兩組間共有373個蛋白表達(dá)差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果提示:飼糧中適宜水平的精氨酸可以通過提高下丘腦NPY和血清NO的含量，降低血清胃饑餓素的含量，進(jìn)而提高蛋雞的采食量;精氨酸對采食量的調(diào)控可能與其提高了下丘腦激素相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，同時降低了肝臟脂肪酸氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平有關(guān)。
　　3精氨酸對蛋雞組織蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控研究
　　本研究探討了精氨酸對蛋雞肝臟和小腸蛋白質(zhì)代謝的影響及其調(diào)控

6、作用的分子機(jī)制。結(jié)果顯示:1.27％精氨酸組血清總蛋白和白蛋白含量最高(P＜0.05)，血清尿酸含量最低（P＜0.05）;與基礎(chǔ)飼糧組相比，1.27％精氨酸組肝臟和空腸蛋白質(zhì)相對合成率最高（P＜0.05）;RT-PCR和Western blot檢測TOR信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，1.27％精氨酸組肝臟TOR、S6K1基因mRNA相對表達(dá)量及TOR蛋白磷酸化最高(P＜0.05)，蛋白質(zhì)降解相關(guān)基因20S蛋白酶體和組織蛋白酶B基因mR

7、NA相對表達(dá)量最低（P＜0.05）;此外，與基礎(chǔ)飼糧組相比，1.27％精氨酸組空腸TOR蛋白相對表達(dá)量及磷酸化水平均顯著提高(P＜0.05)。結(jié)果提示:飼糧中添加適宜水平的精氨酸可以提高蛋雞肝臟和空腸蛋白質(zhì)相對合成率和蛋白質(zhì)相對生長率，精氨酸對肝臟蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用是通過上調(diào)TOR蛋白的表達(dá)和磷酸化水平以及抑制組織蛋白酶B和20S蛋白酶體基因mRNA表達(dá)水平，而精氨酸對空腸蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用主要是通過提高空腸TOR蛋白的表達(dá)和磷酸化

8、水平以及抑制20S蛋白酶體基因mRNA表達(dá)水平。
　　4雞胚小腸上皮細(xì)胞模型的建立
　　本試驗(yàn)比較了不同日齡的雞胚通過不同的消化酶作用后對雞胚腸上皮細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的影響，旨在建立一種適宜的腸上皮細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法，為后續(xù)試驗(yàn)提供材料。選取14 d、16d和18d的SPF雞胚小腸腸段，分別用胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、嗜熱菌蛋白酶及Ⅰ型膠原酶與嗜熱菌蛋白酶聯(lián)合消化。采用免疫組化及免疫熒光染色對細(xì)胞進(jìn)行鑒定，MTT法檢測細(xì)胞增殖。

9、結(jié)果顯示:14d雞胚小腸腸段通過Ⅰ型膠原酶消化分離得到的腸上皮細(xì)胞貼壁及生長均較好;傳代培養(yǎng)后可以產(chǎn)生大量腸上皮細(xì)胞;免疫組化及免疫熒光染色顯示分離得到的細(xì)胞對細(xì)胞角蛋白18抗體呈陽性。結(jié)果提示:選用14d雞胚通過Ⅰ型膠原酶消化，可以分離得到較好的雞胚腸上皮細(xì)胞。
　　5精氨酸對雞小腸上皮細(xì)胞精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　以建立的雞胚小腸上皮細(xì)胞為模型，探討外源精氨酸對堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體1和4(CAT-1、CAT

10、-4)及誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)的影響。細(xì)胞在含10、100、200、400和600μM精氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后，結(jié)果顯示細(xì)胞活力在10-400μM精氨酸范圍內(nèi)達(dá)到最大值;與10μM精氨酸組相比，外源添加100、200和400μM精氨酸顯著增加L-[3H]-精氨酸的吸收、細(xì)胞NO及L-[3H]-瓜氨酸的含量(P＜0.05); CAT-1基因mRNA和蛋白相對表達(dá)量隨著外源精氨酸濃度的增加而增加;精氨酸顯著上調(diào)iNOS基因mR

11、NA相對表達(dá)量（P＜0.05），200和400μM精氨酸組iNOS蛋白相對表達(dá)量顯著高于10和100μM精氨酸組(P＜0.05)。結(jié)果提示:精氨酸能夠提高CAT-1及iNOS基因的表達(dá)水平，增加外源精氨酸的利用率及NO的生成量;CAT-1對精氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)發(fā)揮著重要作用，同時由精氨酸介導(dǎo)通過iNOS產(chǎn)生的NO能夠促進(jìn)細(xì)胞生長。
　　6精氨酸對雞小腸上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　本試驗(yàn)以雞小腸上皮細(xì)胞為模型，旨在探討

12、精氨酸對細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝及TOR通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。細(xì)胞在含10、100、200和400μM精氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4d后，測定細(xì)胞周期、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成與降解、雷帕霉素靶蛋白(TOR)、核糖體蛋白S6激酶(S6K1)及真核生物起始翻譯因子4E結(jié)合蛋白(4E-BP1)基因mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，S和G2/M期細(xì)胞數(shù)量隨著精氨酸濃度的增加而增加，而G0/G1期則降低;與10μML-精氨酸相比，100、200和400μM精氨酸組細(xì)胞蛋白質(zhì)