神經(jīng)生長(zhǎng)因子致哮喘神經(jīng)源性炎癥信號(hào)傳導(dǎo)通路研究.pdf

1、支氣管哮喘是由多種免疫炎癥細(xì)胞(如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等)及其細(xì)胞組份參與的以反復(fù)發(fā)作可逆性氣流受限和氣道高反應(yīng)性為特征的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。目前認(rèn)為，神經(jīng)源性炎癥是支氣管哮喘發(fā)病的重要機(jī)制。最近研究其在NGF所致哮喘神經(jīng)源性炎癥的作用機(jī)制有望成為治療哮喘發(fā)病的新靶點(diǎn)。 第一部分：神經(jīng)生長(zhǎng)因子調(diào)控哮喘大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥的信號(hào)傳導(dǎo)通路初探 通過(guò)雞卵蛋白(OVA)致敏激發(fā)建立哮喘模型，將SD大鼠隨機(jī)分為

2、3組：哮喘組、正常對(duì)照組、抗NGF組，每組12只。模型建立后進(jìn)行以下研究：取肺組織切片HE染色觀(guān)察病理改變，以此觀(guān)察模型的氣道炎癥程度。取三組大鼠肺組織、背根節(jié)采用免疫組化對(duì)pan-Ras、pERK、c-fos蛋白進(jìn)行定位和定性分析。結(jié)果顯示：在肺組織中pan-Ras、pERK、c-fos陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)均呈棕黃色，主要位于細(xì)胞漿中。哮喘組呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，正常對(duì)照組呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。哮喘組pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分別為152

3、.65±15.95、152.89±13.52、130.62±10.46較正常對(duì)照組(pan-Ras、pERK、c-fos 平均灰度值分別為 174.74±14.61、179.55±13.83、165.04±11.57)陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度值均明顯降低(P<0.01)。抗NGF組大鼠肺組織中免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較哮喘組明顯減少，呈弱陽(yáng)性反應(yīng) (pan-Ras、pERK、c-fos 平均灰度值分別為 174.08±14.94、177.80±1

4、5.08 及 165.02±11.33)。背根節(jié)中 pan-Ras、pERK、c-fos陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)均呈棕黃色，pan-Ras、pERK主要位于細(xì)胞漿中，而c-fos 位于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。正常對(duì)照組呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，哮喘組呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，抗NGF組呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。哮喘組pan-Ras、pERK、c-fos平均灰度值分別為 151.40±15.89、154.84±13.22、137.21±13.05 較正常對(duì)照組 171.44±16.43、17

5、5.34±13.24、175.51±7.76明顯降低，P<0.01?？筃GF干預(yù)后，pan-Ras、pERK、c-fos 表達(dá)減少，其灰度值分別為168.41±17.27、170.78±13.34及163.89±8.92，較哮喘組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.05。 第二部分：人支氣管上皮細(xì)胞NGF信號(hào)傳導(dǎo)通路初探 我們選用參與哮喘神經(jīng)源性炎癥的重要效應(yīng)細(xì)胞一正常人支氣管氣道上皮細(xì)胞株(NHBEC)作為研究對(duì)象。NHBEC于含1

6、0％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分8組：(1)A組：正常對(duì)照組；(2)B組：NGF組；(3)C組：NGF+PD98059組；(4)D組：PD98059組；(5)E組：NGF+PMA組；(6)F組：PMA組；(7)G組：NGF+AG490組(8)H組：AG490組。并分別進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)。干預(yù)后免疫印跡法半定量測(cè)定細(xì)胞 c-fos、p-ERK及total-ERK 蛋白含量。RT-PCR方法半定量檢測(cè)各組細(xì)胞NK-1R mRNA含量。并

7、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)定性觀(guān)察各組細(xì)胞表達(dá)NK-1R的情況。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，c-fos 蛋白及磷酸化的ERK1/2蛋白水平在NFG作用30min時(shí)，顯著增高并達(dá)到峰值；而total-ERK蛋白水平則不受NGF影響；在NGF未處理的PD98059組及AG490組c-fos蛋白水平、磷酸化的ERK1/2蛋白水平幾乎檢測(cè)不到；而在NGF組，經(jīng)NGF作用30min后，可見(jiàn)c-fos蛋白水平及磷酸化的ERK1/2蛋白水平顯著增高，c-fos

8、/GAPDH及pERK/GAPDH光密度比值分別為0.8354±0.1012、1.3187±0.2078，與正常對(duì)照組相比P<0.01。PD98059可明顯抑制NGF誘導(dǎo)NHBEC表達(dá)c-fos蛋白及磷酸化的ERK1/2蛋白，c-fos/GAPDH及pERK/GAPDH光密度比值分別為0.3012±0.1034、0.3146±0.0957，與NGF組相比P<0.01。PMA可刺激NGF誘導(dǎo)NHBEC表達(dá)c-fos及磷酸化的ERK1/2蛋

9、白。而STAT3傳導(dǎo)途徑特異性抑制劑AG490則無(wú)此作用。免疫細(xì)胞化學(xué)研究結(jié)果顯示：正常對(duì)照組及PD98059組NK-1R表達(dá)呈陰性反應(yīng)；NGF組及NGF+PMA組呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；PMA組呈陽(yáng)性反應(yīng)；而NGF+PD98059組呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。RT-PCR結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，NK-1RmRNA在NGF未處理的PD98059組表達(dá)較少；而在NGF組，經(jīng)NGF作用1h后，可見(jiàn)NK-1RmRNA水平顯著增高(光密度比值1.0682±0.15

10、97)，與正常對(duì)照組(光密度比值0.3753±0.0642)相比P<0.01。PD98059可抑制NGF誘導(dǎo)NHBEC表達(dá)NK-1RmRNA(光密度比值0.4787±0.0981)。PMA可刺激NGF誘導(dǎo)NHBEC表達(dá)NK-1RmRNA。 第三部分：c-fos RNAi技術(shù)對(duì)NGF Ras-MAPK 信號(hào)通路的影響 培養(yǎng)NHBEC，設(shè)計(jì) c-fos siRNA，通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，再進(jìn)行NGF干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分(1)

11、A組：正常對(duì)照組；(2)B組：NGF組；(3)C組：NGF+dsRNA nonspecific組；(4)D組：NGF+FOS1組；(5)E組： NGF+FOS2組；(6)F組：NGF+FOS3組；(7)G組：NGF+空白載體組。細(xì)胞干預(yù)后分別提取總蛋白免疫印跡半定量測(cè)定各組c-fos蛋白表達(dá)；提取總RNA RT-PCR半定量檢測(cè)NK-1R mRNA，并應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法定性檢測(cè)各組NK-1R表達(dá)。結(jié)果顯示：經(jīng)NGF刺激后，c-f

12、os蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加，c-fos/GAPDH 吸光度比值為1.1861±0.1427，較正常對(duì)照組(吸光度比值0.3122±0.0914)，P<0.01；c-fos shRNA可抑制NGF誘導(dǎo)NHBEC 表達(dá)c-fos 蛋白，c-fos/GAPDH 吸光度比值分別為1.0965±0.2591、0.6574±0.1373、0.3773±0.136；與NGF組比較，P<0.01；無(wú)關(guān)shRNA，空質(zhì)粒均無(wú)此作用。與正常對(duì)照組相比

13、，NHBEC經(jīng)NGF作用1h后，可見(jiàn)NK-1RmRNA水平顯著增高，NK-1RmRNA/beta-actin吸光度比值為1.0047±0.1106，與對(duì)照組(NK-1 RmRNA/beta-actin 吸光度比值為0.413±0.0473)比較，P<0.01。FOS3可抑制NGF誘導(dǎo)NHBEC表達(dá)NK-1R mRNA，其N(xiāo)K-1RmRNA/beta-actin 吸光度比值為0.6214±0.0971與NGF組相比P<0.01。無(wú)關(guān)shR

14、NA，空質(zhì)粒均無(wú)此作用。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示NK-1R陽(yáng)性產(chǎn)物為棕黃色，以NHBEC胞漿著色為主。正常對(duì)照組NK-1R表達(dá)呈陰性反應(yīng)；NGF組及NGF+HK siRNA組呈強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)；NGF+無(wú)關(guān)siRNA組呈陽(yáng)性反應(yīng)；而NGF+siRNA組呈弱陽(yáng)性反應(yīng)。 上述三個(gè)部分研究提示NGF通過(guò)調(diào)控神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)SP參與哮喘神經(jīng)源性炎癥機(jī)制，其信號(hào)通路可能是Ras-MAPK途徑。阻斷Ras-MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路，有望成為治療哮喘的新途