神經(jīng)生長因子調(diào)控慢性阻塞性肺疾病氣道神經(jīng)源性炎癥研究.pdf

1、吸煙是人類慢性阻塞性肺疾病(COPD)的主要致病因素，香煙中有害成份首先攻擊氣道上皮，氣道上皮的損傷及炎癥是COPD的重要病理特征，氣道上皮的功能缺陷與氣道疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，目前研究證實(shí)COPD等氣流受限性疾病發(fā)病過程中，氣道上皮損傷時(shí)，炎性細(xì)胞活化并浸潤于氣道，使氣道壁感覺神經(jīng)末梢暴露、氣道神經(jīng)及神經(jīng)肽的表型和含量均發(fā)生變化，眾多神經(jīng)肽如P物質(zhì)(SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)等大量釋放，它們通過多種形式影響氣道組織并可誘

2、發(fā)神經(jīng)源性炎癥，表現(xiàn)為氣道腺體分泌增加、血管擴(kuò)張和血管通透性增加、氣道平滑肌收縮、氣道炎癥細(xì)胞活化等。采用單一介質(zhì)拮抗劑所起治療作用往往有限，因此研究調(diào)節(jié)神經(jīng)肽釋放的化學(xué)物質(zhì)可能是阻斷慢性炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要途徑。近年來，神經(jīng)生長因子(NGF)由于具有高效的調(diào)控神經(jīng)肽作用而受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。在多種炎癥性疾病中NGF表達(dá)增加，NGF由外周靶細(xì)胞(包括免疫炎癥細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞如氣道上皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等

3、)合成并釋放，并可被神經(jīng)軸突末梢攝取，逆行運(yùn)輸至背根節(jié)，使背根節(jié)感覺神經(jīng)元的敏感性增高，使合成并釋放SP、CGRP等增加。我們的前期研究結(jié)果顯示大鼠腹腔注射NGF后，肺組織中SP的受體即神經(jīng)激肽受體1(NK-1R)表達(dá)上調(diào)，提示NGF可調(diào)節(jié)神經(jīng)肽釋放，應(yīng)用抗NGF抗體可減輕RSV感染引起的肺組織神經(jīng)源性炎癥，并使肺組織NK-1R表達(dá)下調(diào)。 綜上所述，我們提出假說：COPD存在NGF表達(dá)增高；NGF通過上調(diào)SP等神經(jīng)肽調(diào)控COPD

4、氣道神經(jīng)源性炎癥。由此，本實(shí)驗(yàn)測定COPD患者NGF水平，并在已建立的COPD模型中檢測NGF及SP的變化，進(jìn)一步用抗NGF干預(yù)以觀測COPD大鼠下呼吸道及背根節(jié)SP水平的改變，旨在探討NGF在實(shí)驗(yàn)性COPD大鼠中作用及初步機(jī)制，以尋求人類COPD治療的新靶點(diǎn)。為證明上述假設(shè)我們完成了以下研究內(nèi)容。 第一部分：COPD患者血清NGF變化及與肺功能關(guān)系研究 本部分對COPD患者體內(nèi)NGF的變化進(jìn)行了初步研究，以期進(jìn)一步探討

5、和揭示人類COPD發(fā)病機(jī)制。我們以ELISA法測定COPD急性加重期患者(31例)、穩(wěn)定期患者(30例)及正常對照組24例血清NGF水平，并檢測同期FEV<,1>/FVC、FEV<,1>％pre等肺功能指標(biāo)。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：COPD急性加重期、穩(wěn)定期患者，正常對照者血清NGF蛋白水平分別為30.3±11.7ng/L，17.2±8.5ng/L，7.29±3.4ng/L。與正常對照者相比，COPD急性加重期、穩(wěn)定期患者NGF蛋白水平顯著

6、升高(均為P<0.05)，且COPD急性加重期患者明顯高于穩(wěn)定期患者(P<0.05)。無論是COPD急性加重期還是穩(wěn)定期患者血清NGF蛋白水平與 FEV<,1>％pre、FEV<,1>/FVC％均呈負(fù)相關(guān)，在急性加重期分別為rs=-0.73，rs=-0.72(均P<0.01)，在穩(wěn)定期分別為rs=-0.65，rs=-0.68(均P<0.05)。 研究結(jié)果提示NGF可能直接參與或調(diào)控COPD炎癥，在患者急性加重期與穩(wěn)定期的整個(gè)病程

7、中發(fā)揮作用。 第二部分：COPD模型的建立 首先采用煙熏加氣管內(nèi)注入豬胰彈性蛋白酶的方法建立大鼠慢性阻塞性肺疾病的動(dòng)物模型。并將Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組、正常對照組，每組15只。并從肺功能測定、HE染色觀察肺組織病理變化及BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)等多方面來證實(shí)模型的成功性。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與正常對照組比較：(1)肺功能：COPD模型組大鼠PEF(23.61±2.67 ml/s vs 30.96±2.88 ml/s)

8、、FEV<,0.3>(3.49±0.42mlvs 4.86±0.36 ml)和FEV<,0.3>/FVC((62.25±4.84)％vs(86.68±6.12)％]顯著下降(均P<0.01)；(2)病理改變：平均內(nèi)襯間隔(136.92±16.71 μm vs 36.70±4.48μm)明顯增高，平均肺泡數(shù)(11.07±0.26個(gè)/μm<'2> vs 24.40±2.83個(gè)/μm<'2>)明顯降低(均P<0.01)：(3)BALF炎癥細(xì)胞

9、：細(xì)胞總數(shù)(10<'4>/ml)(23.93±3.52 vs 15.27±2.40)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(％)均明顯增高(7.56±1.47 vs 1.80±0.68)(均P<0.01)。研究證實(shí)煙熏加氣管內(nèi)滴入豬胰彈性蛋白酶的方法可建立穩(wěn)定的大鼠慢性阻塞性肺疾病的動(dòng)物模型，模型組大鼠有氣道炎癥和肺氣腫改變，小氣道阻力增加，有阻塞性通氣功能障礙。 第三部分：NGF在COPD大鼠中的作用及其機(jī)制初探。 為探討NGF在COPD大

10、鼠中的作用及機(jī)制，同上方法建立COPD模型和分組：正常對照組、COPD組及抗NGF抗體干預(yù)組，每組15只。模型建立后測定肺功能、BALF炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)并取肺組織采用HE染色觀察肺組織病理變化，同時(shí)采用ELISA法測定COPD大鼠BALF中NGF水平，免疫組化法觀測三組肺組織、背根神經(jīng)節(jié)NGF、SP及肺組織NK-1R變化，原位雜交比較三組背根神經(jīng)節(jié)SP水平，RT-PCR半定量法測定COPD組及正常對照組肺組織、背根神經(jīng)節(jié)NGFmRNA表達(dá)，

11、Western-blot法檢測三組NGF蛋白水平變化。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)COPD模型組與正常對照組比較：；BALF中NGF蛋白水平(ng/L)顯著升高(187.18±64.76 vs 75.13±20.44.P<0.001)：肺組織及背根神經(jīng)節(jié)NGF蛋白表達(dá)無論是免疫組化(平均灰度值104.23±7.74 vs 153.50±8.02，108.95±7.02 vs 171.03±8.14，灰度值越高表明其在細(xì)胞中表達(dá)的量越低)，

12、還是 Western blot(400.4±51.6ng/L vs 198.5±46.2ng/L，318.8±52.6ng/L vs144.2±32.7ng/L)表達(dá)均明顯增高(均P<0.01)；NGF mRNA在肺組織顯著增高(82.07±7.89 vs 51.80±8.34)(P<0.01)，在背根節(jié)無顯著升高(56.67±6.28 vs 51.87±7.01)(P>0.05)；NK-1R在肺組織表達(dá)顯著升高(平均灰度值101.33

13、±6.31 vs 157.67±8.15)(P<0.01)：SP在背根節(jié)表達(dá)顯著增高(平均灰度值103.40±7.08 vs167.06±7.83)(P<0.05)；SPmRNA在肺組織無顯著升高(平均灰度值165.53±7.30 vs 168.07±7.05)(P>0.05)，在背根節(jié)表達(dá)顯著增高(平均灰度值103.58±9.63 vs 173.37±12.83)(P(0.01)。(2)抗NGF組與COPD組相比較：肺組織及背根神經(jīng)節(jié)

14、NGF蛋白表達(dá)無論是免疫組化(平均灰度值130.78±6.35 vs 104.23±7.74，135.68±7.13 vs108.95±7.02)，還是Western blot(297.9±43.3ng/L vs 400.4±51.6ng/L，222.3±46.6ng/L vs 318.8±52.6ng/L)表達(dá)均明顯降低(均P(0.01)；NK-1R在肺組織顯著降低(平均灰度值138.20±7.99vs 101.33±6.31)(P<

15、0.01)；SP在背根節(jié)表達(dá)顯著降低(平均灰度值138.00±9.32 vs 103.40±7.08)(P<0.01)；SPmRNA在背根節(jié)顯著降低(平均灰度值143.21±11-30 vs 103.58±9.63)(P<0.01)；(3)COPD組大鼠肺組織NGFmRNA與背根節(jié)SPmRNA灰度值表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.81，P(0.001)。(4)抗NGF組與COPD組比較，BALF細(xì)胞總數(shù)(17.13±3.94 vs 23.93

16、±3.52)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降(4.65±0.80 vs 7.56±1.47)(P<0.01)；肺功能PEF(27.88±2.98 vs 23.61±2.67)FEV<,0.3>(3.93±0.25 vs 3.49±0.42)與FEV<,0.3>/FVC(71.48±5.38 vs 62.25±4.84)顯著增高(均P<0.05)；形態(tài)學(xué)上，平均內(nèi)襯間隔明顯下降(101.88±19.67 vs 136.92±16.71，P<0.0

17、1)。研究結(jié)果；發(fā)現(xiàn)NGF參與大鼠COPD形成，首次證實(shí)NGF干預(yù)能有效抑制COPD大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥，改善COPD病理變化及氣流阻塞，其機(jī)制可能與下調(diào)氣道感覺神經(jīng)元合成和分泌SP表達(dá)有關(guān)。 上述三個(gè)部分研究提示NGF通過調(diào)節(jié)氣道感覺神經(jīng)元合成和分泌SP表達(dá)參與COPD神經(jīng)源性炎癥，在COPD氣流阻塞中發(fā)揮作用；同時(shí)抗NGF干預(yù)可下調(diào)SPmRNA表達(dá)和蛋白分泌水平，減輕COPD氣道炎癥。因此我們可以這樣認(rèn)為：NGF作為氣道神經(jīng)