JAK-STAT信號(hào)途徑在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用及AT1Ra和補(bǔ)腎活血方劑的影響.pdf

1、目的：腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路，是導(dǎo)致終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)。大量的研究表明，在各種原因引起的慢性腎臟疾病中，腎間質(zhì)纖維化都可作為腎功能惡化的一個(gè)十分準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)指標(biāo)。腎間質(zhì)纖維化的程度與腎功能的相關(guān)性比腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切。腎間質(zhì)纖維化的一個(gè)重要機(jī)制就是肌成纖維細(xì)胞(myofiberoblast,Myof)增多及活化。目前

2、Myof的來源還不完全清楚，但越來越多的研究證實(shí)腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，或者稱為腎小管上皮細(xì)胞一肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變(epithelial- myofiberoblast transition，EMT)是其主要來源之一，但其信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制至今尚未闡明。Janus kinase/signal transducer and activators of transcripti on (JAK/STAT)信號(hào)途徑能介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的細(xì)胞內(nèi)

3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種行為密切相關(guān)。研究表明，高糖和血管緊張素Ⅱ等均可激活體外培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞JAK/STAT 途徑。但此信號(hào)途徑在腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中的作用鮮見研究報(bào)道。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)和血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(angiotensin recepter blockade，ARB)具有腎臟保護(hù)作用，已成為治療慢性

4、腎衰的常用藥物，但其對(duì)EMT的影響目前研究較少。 本研究應(yīng)用高糖培養(yǎng)人腎小管上皮細(xì)胞株(HKC)和大鼠5/6腎切除(5/6 subtotal nephrectomy STNx)模型，從整體、細(xì)胞和分子等不同水平，系統(tǒng)觀察了EMT 及其過程中JAK/STAT信號(hào)途徑的變化，以及血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑和補(bǔ)腎活血方劑的影響，以進(jìn)一步探討EMT在慢性腎纖維化中的作用及其發(fā)病機(jī)制和防治措施。 方法 1．體外培養(yǎng)HKC細(xì)胞E

5、MT 及JAK/STAT 信號(hào)途徑的檢測(cè)HKC分成4組：LG組(5.5mmol/L葡萄糖)；LG+M組(5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇)；HG組(30mmol/L葡萄糖)；HG+AG490組(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L AG490)。分別在24孔板和25 cm<'2>塑料培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)6、12、24、48、72h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白、RNA及采集細(xì)胞上清液。采用免疫沉淀和Western印跡檢

6、測(cè)JAK2磷酸化表達(dá)；免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)STAT1、STAT3、P-STAT1、P-STAT3、α-SMA和E-Cadherin等的表達(dá)；半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞上清液中I型膠原和TGF-β1 的分泌。 2.纈沙坦治療后HKC細(xì)胞EMT及JAK/STAT信號(hào)途徑變化的檢測(cè)HKC分成3組：LG組(5.5mmol/L葡萄糖)；HG組(30mmol/L葡萄糖)

7、；HG+Val組(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L纈沙坦)。分別于刺激的6、12、24、48、72h后收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白、RNA 及收集細(xì)胞上清液。采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和Western blot檢測(cè)STAT1、STAT3、P-STATl、p-STAT3、α-SMA和E-Cadherin等的表達(dá)；免疫沉淀和Western印跡檢測(cè)JAK2磷酸化表達(dá)；半定量RT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)細(xì)胞上清

8、液中Ⅰ型膠原和TGF-β1的分泌。 3.氯沙坦治療后對(duì)STNx大鼠的 EMT 及J A K/S TA T信號(hào)途徑的檢測(cè)54只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、STNx組和STNx+氯沙坦組，治療組每日給予氯沙坦20mg·Kg·d<'-1>灌胃，各組分別于2次手術(shù)后第4、8、12周各取6只大鼠，稱重后收集24h尿，測(cè)定尿蛋白(Upro)；取血測(cè)定尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)；取部分腎組織置于4％多聚甲醛固定用于光鏡觀察及免疫組化

9、檢測(cè)，部分腎皮質(zhì)組織用于分離腎小管細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白。免疫組織化學(xué)染色法和Western blot檢測(cè)腎小球α-SMA、JAK2、STAT1、p-STAT1、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)；免疫沉淀和Western blot檢測(cè)JAK2酪氨酸磷酸化；半定量RT-PCR 檢測(cè)腎小球TGF-β1mRNA、STAT1 mRNA和STAT3 mRNA表達(dá)。 4.補(bǔ)腎活血方劑治療后對(duì)STNx大鼠的EMT及JAK/STAT

10、信號(hào)途徑的檢測(cè)SD雄性大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組(A)、STNx組(B)和STNx+補(bǔ)腎活血方劑治療組(C)。治療組每日給予中藥方劑20ml/kg灌胃。正常對(duì)照組和糖尿病組給予等量蒸餾水灌胃。于治療后4、8、12周收集血、尿和腎組織。部分腎組織經(jīng)4％多聚甲醛固定形態(tài)學(xué)觀察和免疫組化。應(yīng)用免疫組化、Western blot、免疫沉淀和Westem blot以及RT-PCR等方法，觀察對(duì)STNx大鼠腎小管上皮細(xì)胞JAK2、p-JAK2、 S

11、TAT1、p-STAT1、STAT3和 p-STAT3蛋白及 TGF-β1mRNA、STAT1 mRNA和STAT3mRNA表達(dá)的影響。 結(jié)果 1.JAK/STAT 信號(hào)途徑對(duì)高糖誘導(dǎo)的EMT的影響 ①免疫熒光細(xì)胞化學(xué)顯示，四種STAT信號(hào)蛋白在HKC細(xì)胞核和細(xì)胞漿均有表達(dá)。與低糖組比較，高糖組p-STAT1和 p-STAT3 表達(dá)增強(qiáng)，且增強(qiáng)部位為細(xì)胞核，提示活化后的STAT1和STAT3出現(xiàn)核轉(zhuǎn)移。AG490

12、處理組與高糖組相比，p-STAT1 和p-STAT3的表達(dá)明顯降低， STAT1和STAT3的核轉(zhuǎn)移減少。②與低糖組相比，高糖組HKC細(xì)胞JAK2磷酸化明顯增強(qiáng)(P<0.01)。AG490處理組JAK2磷酸化明顯被抑制(P<0.01)。③Western blot顯示，與同期低糖組相比，高糖組p-STAT1和p-STAT3表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。AG490處理組 p-STAT1和p-STAT3表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。 STAT

13、1和STAT3在各組表達(dá)無明顯差異。④免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和western blot結(jié)果均顯示：高糖組隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)α-SMA 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，E-Cadherin的表達(dá)明顯減弱；與高糖組比較，AG490組細(xì)胞內(nèi)α-SMA 的表達(dá)明顯降低，E-Cadherin表達(dá)明顯升高。⑤TGF-β1 mRNA在低糖對(duì)照組有少量表達(dá)(0.21±0.04)，在高糖組TGF-β1 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(0.73±0.08)，和對(duì)照組相比差異顯著(P

14、<0.01)。AG490處理組細(xì)胞 TGF-β1 mRNA的表達(dá)明顯降低(0.49±0.07，P<0.01)。⑥高糖刺激HKC的上清液中 TGF-β1和Ⅰ型膠原分泌增加，與低糖對(duì)照組差異顯著(P<0.01)。AG490處理組細(xì)胞 TGF-β1和Ⅰ型膠原的分泌減少(與高糖組相比，P<0.01)。 2.纈沙坦通過JAK/STAT 途徑對(duì)高糖誘導(dǎo)的EMT 的影響 結(jié)論：①高糖能夠刺激HKC細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)升高；α-

15、SMA表達(dá)增強(qiáng)；細(xì)胞上清液中的TGF-β1、Ⅰ型膠原的分泌增多；表明高糖刺激能引起EMT的發(fā)生。與之同時(shí)，高糖還引起HKC細(xì)胞中信號(hào)蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化增強(qiáng)；提示高糖可誘導(dǎo)JAK/STAT信號(hào)途徑的激活。JAK2特異性抑制劑AG490能夠降低高糖刺激引起STAT1和STAT3的磷酸化，抑制細(xì)胞TGF-β1mRNA和α-SMA 表達(dá)的升高，使上清中的TGF-β1、Ⅰ型膠原的含量減少。表明JAK/STAT 信號(hào)途徑參

16、與了高糖誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生。②纈沙坦在一定程度上抑制了JAK/STAT信號(hào)途徑的活化，下調(diào) TGF-β1mRNA 的表達(dá)，抑制高糖刺激引起的細(xì)胞 TGF-β1 及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的分泌。提示纈沙坦的腎臟保護(hù)作用可能部分是通過抑制JAK/STAT 信號(hào)途徑實(shí)現(xiàn)的。③氯沙坦治療能夠明顯抑制STNx大鼠腎小管細(xì)胞中的信號(hào)蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化，下調(diào)腎小管細(xì)胞 TGF-β1mRNA的表達(dá)，抑制EMT 的發(fā)生，減輕了腎小管細(xì)胞

17、的損傷，延緩了腎功能衰竭的發(fā)生，其腎臟保護(hù)作用可能部分是通過影響JAK/STAT 信號(hào)途徑活化及EMT 的進(jìn)程而實(shí)現(xiàn)的。④補(bǔ)腎活血方劑能下調(diào)STNx大鼠腎小管細(xì)胞中STAT1和STAT3 mRNA的表達(dá)，明顯抑制信號(hào)蛋白JAK2、STAT1和STAT3的磷酸化，下調(diào)腎小管細(xì)胞TGF-β1mRNA的表達(dá)，明顯減少腎小管細(xì)胞α-SMA的表達(dá)，抑制EMT的發(fā)生，減輕了腎小管細(xì)胞的損傷，在一定程度上保護(hù)了腎功能。其腎臟保護(hù)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。