限制性體位窒息死亡大鼠的膈肌研究.pdf

1、1.研究背景與目的： 近年來，由于限制性體位窒息案例的發(fā)生率猛增，已引起國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)家們的極大關(guān)注，并且已被確認(rèn)為亟待解決的法醫(yī)學(xué)疑難課題之一。因為此種窒息表現(xiàn)缺乏口鼻部、頸部組織的損傷支持，故無法準(zhǔn)確解釋其死亡機(jī)制，也缺乏特異、敏感的形態(tài)學(xué)鑒定指標(biāo)，往往引起鑒定結(jié)果的爭議。 國內(nèi)的陳玉川和我的導(dǎo)師競花蘭等學(xué)者進(jìn)行了一系列研究，首先使用“限制性體位性窒息”來命名這種死亡方式，用于解釋當(dāng)事人處于一定的限制性體位下，經(jīng)過一段

2、時間后發(fā)生死亡的案件。姜富學(xué)、張宜俊等以家兔建立體位性窒息模型，通過血?dú)夥治觥㈦跫〖‰姼淖?、和形態(tài)學(xué)觀察等手段對限制性引起死亡的機(jī)制進(jìn)行了一系列探討。本研究旨在前人對限制性體位窒息死亡的實驗研究和案例報道的基礎(chǔ)上，建立動物模型，探索膈肌的變化，繼續(xù)研究在限制性體位下發(fā)生窒息死亡的機(jī)制，并提供新的證明手段。 2.材料與方法： 2.1實驗動物與分組32只成年雄性Wister大鼠(由中山大學(xué)實驗動物中心提供)，體重200±10

3、g。將大鼠隨機(jī)分成4組，每組8只，分別采用以下方法處理：Ⅰ組(對照組)直接斷頸處死；Ⅱ組固定四肢1小時后斷頸處死；Ⅲ組固定四肢并以400克重物壓迫肩背部1小時后斷頸處死；Ⅳ組固定四肢并以600克重物壓迫肩背部直至大鼠死亡。 2.2體外膈肌收縮特性研究預(yù)先制作膈肌收縮張力體外測量裝置，選擇單刺激電壓及測定最適前負(fù)荷。大鼠死亡后迅速取出約1cm寬的大鼠膈肌左前側(cè)肌條，測量等長單收縮張力Pt，等長最大強(qiáng)直收縮張力P0和張力——頻率關(guān)系

4、。所得數(shù)據(jù)先用SPSS13.0建立數(shù)據(jù)庫，輸入各組數(shù)據(jù)，若方差齊，則實驗結(jié)果采用One-way單因素方差分析；若方差不齊，則采用Kruskai-Wallis秩和檢驗。 2.3形態(tài)學(xué)觀察大鼠死亡后，取膈肌一小塊，用10％福爾馬林液固定3天后，進(jìn)行常規(guī)脫水、石蠟包埋、2μm切片，進(jìn)行HE染色，鏡下觀察、顯微照相。 2.4免疫熒光組織化學(xué)染色抗體采用兔抗鼠組織纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)n)和熱休克蛋白70型(He

5、atShockProtein70，HSP70)。組織選用同HE染色。染色時Fn抗體用Cy3標(biāo)記，顯紅色熒光，HSP70抗體用FITC標(biāo)記，顯黃綠色熒光。 2.5熒光顯微鏡觀察、拍照和圖像分析在低倍鏡下找到膈肌細(xì)胞陽性產(chǎn)物后，調(diào)至100倍和400倍，隨機(jī)選取拍照。陽性反應(yīng)強(qiáng)度用圖像處理系統(tǒng)灰度級表示，得到陽性膈肌細(xì)胞的平均灰度級后，將數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，方法同前。 3.研究結(jié)果： 3.1實驗組大鼠死亡過程中的表現(xiàn)實

6、驗組大鼠出現(xiàn)呼吸頻率快、煩躁不安、掙扎、張嘴呼吸、口唇紫紺等表現(xiàn)，至死亡前出現(xiàn)反常呼吸，嘆氣樣呼吸和膈肌痙攣表現(xiàn)。第Ⅰ組大鼠斷頸后迅速死亡，第Ⅱ、Ⅲ組大鼠于60分鐘時斷頸處死，第Ⅳ組大鼠的死亡時間為97.5±28.9分鐘。 3.2膈肌體外收縮特性檢測結(jié)果第Ⅳ組大鼠的膈肌條均未引出收縮。Pt在Ⅰ-Ⅲ組間無差異(P＞0.05)；P0在Ⅰ和Ⅱ組間無差異(P＞0.05)，Ⅲ組的P0比Ⅰ和Ⅱ組顯著減小(P＜0.05)。TPT與1/2RT也

7、無組間差異(P＞0.05)。比較大鼠的膈肌條在不同頻率的串刺激下產(chǎn)生的等長收縮張力曲線發(fā)現(xiàn)，第Ⅲ組大鼠的曲線較Ⅰ、Ⅱ組明顯降低(P＜0.05)，Ⅰ、Ⅱ組之間的曲線無明顯變化(P＞0.05)。 3.3HE染色觀察結(jié)果限制性體位組大鼠膈肌中血管內(nèi)可見大量紅細(xì)胞淤積，部分膈肌細(xì)胞排列扭曲，肌纖維斷裂，肌間隙增寬，肌細(xì)胞周圍有紅細(xì)胞散在分布。對照組中無明顯改變。 3.4免疫熒光組織化學(xué)染色觀察結(jié)果各組大鼠均有相應(yīng)抗體的表達(dá)。對照

8、組Fn熒光顯示抗原主要分布于血管和血管周圍基質(zhì)，肌纖維僅有微弱的熒光。實驗組中損傷的膈肌肌內(nèi)膜上有明亮熒光，肌漿上的熒光弱，故熒光呈篩孔狀分布。間質(zhì)內(nèi)的熒光圍繞血管遞減分布。隨著膈肌損傷程度加重肌內(nèi)膜上的熒光增強(qiáng)，呈網(wǎng)狀或條索狀，血管周圍基質(zhì)出現(xiàn)熒光堆積，肌纖維輪廓不清，肌纖維間排列重疊或疏松扭曲，其形態(tài)與HE染色所見肌纖維損傷一致。 HSP70抗體主要分布于肌纖維內(nèi)，細(xì)胞核分布尤為明顯。血管壁和紅細(xì)胞也有明顯分布。肌纖維間無明

9、顯分布。隨著體位限制程度加重，肌纖維內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯增加，部分肌纖維內(nèi)呈顆粒狀聚集，分布較均勻，肌內(nèi)膜和細(xì)胞間的分布也有增加，部分肌內(nèi)膜上呈斑點(diǎn)、片狀聚集。 Fn抗體的表達(dá)在Ⅲ、Ⅳ組之間無差異(P＞0.05)，其余各組間有明顯差異(P＜0.05)。HSP70抗體表達(dá)在第Ⅰ、Ⅱ組間和在第Ⅲ、Ⅳ組之間差異無顯著性意義(P＞0.05)，在其它組之間有顯著差異(P＜0.05)。 4.討論： 4.1研究膈肌損傷在限制性體位

10、窒息中的意義和本實驗的特點(diǎn)在研究對象的選取上，本實驗專注于膈肌。窒息是限制性體位下發(fā)生死亡的重要原因，膈肌作為主要的呼吸肌，在這一過程中起了十分重要的作用。本實驗的特點(diǎn)和創(chuàng)新性在于：采用公認(rèn)的判斷膈肌疲勞的方法——力學(xué)特性的變化，對膈肌存在疲勞直接加以證明；將免疫熒光手段結(jié)合組織化學(xué)，對膈肌細(xì)胞進(jìn)行觀察，實驗手段更靈敏、直觀，穩(wěn)定性和可重復(fù)性大大提高。 4.2膈肌體外收縮特性呼吸肌是呼吸運(yùn)動的主要動力，而膈肌是最重要的吸氣肌。膈

11、肌疲勞是指膈肌在負(fù)荷下活動而導(dǎo)致其產(chǎn)生力量和(或)速度的能力下降。膈肌疲勞與呼吸衰竭的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。 本實驗采用測量膈肌體外收縮特性的方法直接證明了在限制性體位下，大鼠的膈肌發(fā)生了疲勞。在動物實驗中，膈肌疲勞的程度取決于呼吸運(yùn)動受限制程度的大小和時間長短。當(dāng)僅有限制體位，而沒有外力壓迫于背部時，膈肌張力和呼吸運(yùn)動并無顯著改變；當(dāng)作用于背部的外力加大時，呼吸運(yùn)動導(dǎo)致膈肌疲勞的速度大大加快了；當(dāng)膈肌疲勞至無法收縮時，大鼠窒息

12、死亡。在這一過程中最重要的是有無足夠的力量限制了死者生前的呼吸運(yùn)動，并且持續(xù)了足夠長的時間。限制力量與時間不足的單純限制體位并不足以導(dǎo)致肺通氣功能障礙。 4.3Fn的免疫熒光染色Fn幾乎分布在人體所有的部位，包括血漿和許多組織的細(xì)胞外基質(zhì)中，這些細(xì)胞為成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。組織損傷后的早期，F(xiàn)n在傷口及其附近的濃度大大增加，這是由于傷口周圍的血管對Fn的通透性增高，使血漿的Fn向傷口滲入以及受傷區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞

13、、成纖維細(xì)胞大量合成、分泌這種糖蛋白的結(jié)果。本實驗中Fn在各組間表達(dá)的差異體現(xiàn)了隨著體位限制程度的增加而增加的規(guī)律，F(xiàn)n在膈肌中的表達(dá)增強(qiáng)主要是由于膈肌細(xì)胞損傷造成的，證明膈肌的損傷在不同組別之間逐漸加重。Fn是一個反映細(xì)胞損傷程度的較為穩(wěn)定的指標(biāo)，有望在實際檢驗中進(jìn)行應(yīng)用。 檢測Fn的表達(dá)也可以采用原位雜交方法的mRNA的表達(dá)，優(yōu)點(diǎn)是具有較高的靈敏度和特異性，但受蛋白質(zhì)表達(dá)時間的限制，該方法不適用于發(fā)生體位性窒息死亡的個體，且

14、實驗手段復(fù)雜，不適用于法醫(yī)學(xué)日常檢驗。免疫熒光組織化學(xué)染色較傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)手段更加靈敏，特異性更強(qiáng)，可以作為一個可靠的可重復(fù)手段進(jìn)行應(yīng)用。 4.4Hsp70的免疫熒光染色HSP又稱應(yīng)激蛋白，是所有原核細(xì)胞和真核細(xì)胞在高溫或應(yīng)激情況下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的蛋白質(zhì)分子家族，許多生理、病理以及應(yīng)激因素均可以誘導(dǎo)HSP產(chǎn)生。多數(shù)學(xué)者的研究認(rèn)為，一次急性運(yùn)動對HSP70的表達(dá)即有激活作用，能穩(wěn)定增加HSP70mRNA的聚集，但仍

15、不足以影響已經(jīng)高基礎(chǔ)水平的蛋白質(zhì)。本實驗中，對照組已有HSP70抗體明顯分布，實驗組中抗體改變較Fn遲，且組間差異小于Fn，但也隨著限制程度的加重而呈增加趨勢。與人體實驗中HSP的出現(xiàn)時間相比較慢，損傷1小時的大鼠膈肌細(xì)胞上已有HSP70的明顯表達(dá)增加，考慮原因為本實驗?zāi)Ｐ蛯﹄跫〖?xì)胞造成的損傷較人體實驗重，以及存在種屬差異，這有待人體樣本實驗進(jìn)一步證實。 5.結(jié)論： 5.1限制性體位可以導(dǎo)致大鼠的膈肌發(fā)生疲勞，該狀態(tài)持續(xù)