嗅成鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)基對中樞神經(jīng)元的抗凋亡的實驗研究.pdf

1、背景和目的： 成熟哺乳類動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)受到諸如缺血等原因的損傷后由于缺血中心大量神經(jīng)元的死亡，造成嚴(yán)重的功能障礙。周圍神經(jīng)系統(tǒng)具有再生的能力，但是中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力有限。因此中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力一直是神經(jīng)科學(xué)中十分重視的問題。人們不斷嘗試各種可能的方法促進(jìn)損傷后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生，包括增加外源性營養(yǎng)因子、干擾體內(nèi)的抑制因子、細(xì)胞移植等方法，并取得了一定的效果。近年來研究發(fā)現(xiàn)，嗅神經(jīng)終身可以再生，并且再生的軸突可以穿越CN

2、S-PNS交接區(qū)，重建突觸聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)嗅神經(jīng)的再生能力和嗅覺系統(tǒng)中的一種膠質(zhì)細(xì)胞-嗅成鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells，OECs)相關(guān)。人們通過OECs移植的體內(nèi)、體外實驗證實，OECs能介導(dǎo)受損的神經(jīng)元的軸突再生出芽，并形成相應(yīng)的突觸聯(lián)系，從而修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，因此OECs成為研究中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生的熱點。但是，OECs對缺血缺氧的中樞神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用鮮有報導(dǎo)，尤其是OECs分泌的神經(jīng)營養(yǎng)

3、因子對中樞神經(jīng)元的抗凋亡的作用如何?本研究建立了培養(yǎng)、純化OECs的方法，制備OECs條件培養(yǎng)基，通過體外實驗觀察OECs條件培養(yǎng)基對缺血缺氧的皮層神經(jīng)元的抗凋亡作用，進(jìn)一步探討OECs細(xì)胞對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用。 材料與方法： 1、細(xì)胞培養(yǎng)： 1.1.嗅成鞘細(xì)胞的原代培養(yǎng)從出生1～2天的SD(Sprague-Dawley,SD)大鼠的嗅球(Olfactory Bulb，O B)取材進(jìn)行OECs原代培養(yǎng)。利用差

4、速貼壁方法進(jìn)行純化培養(yǎng)，清除絕大部分神經(jīng)元及其它混雜細(xì)胞，使細(xì)胞成分相對單一化。低親和力神經(jīng)生長因子受體抗體(loW affinity．growth factor receptor,p75NGR)免疫染色鑒定OECs，待其融合度達(dá)70％左右時，制備條件培養(yǎng)基。 1.2.皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)從出生24小時內(nèi)的SD(Sprague-Dawley，SD)大鼠的大腦半球取材進(jìn)行皮層神經(jīng)元的原代培養(yǎng)。通過降低血清濃度和加入阿糖胞苷(Ara

5、-C)進(jìn)行純化培養(yǎng)，清除絕大部分膠質(zhì)細(xì)胞及其它混雜細(xì)胞，使細(xì)胞成分相對單一化。MAP-2免疫染色鑒定皮層神經(jīng)元，培養(yǎng)至第5～6天，制備缺血缺氧模型。 1.3.條件培養(yǎng)基的制備OECs純化培養(yǎng)后，待其融合度達(dá)70％左右時，去除原有培養(yǎng)基，加入無血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后取出作為條件培養(yǎng)基備用。 2、缺血缺氧皮層神經(jīng)元模型的制備皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至第6天，分為三組： (1)正常對照組，按正常的半量換液。 (2)

6、缺血缺氧組，撤除正常神經(jīng)元培養(yǎng)基，換為缺氧液，放入密閉容器中，通入5％CO2和95％N2，密閉培養(yǎng)兩個小時后，換為復(fù)氧液，繼續(xù)培養(yǎng)6小時。 (3)OECs條件培養(yǎng)基組，皮層神經(jīng)元培養(yǎng)至第5天，撤除正常神經(jīng)元培養(yǎng)基，加入OECs條件培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時后，制備缺血缺氧模型。 使用Hochest33342、MTT、Tunel試劑盒檢測神經(jīng)元的凋亡和存活率。 主要結(jié)果與結(jié)論： 主要結(jié)果： (1)采用

7、差速貼壁法進(jìn)行OECs純化培養(yǎng)，細(xì)胞增長快，純度可達(dá)90％； (2)采用降低血清濃度和添加阿糖胞苷法進(jìn)行皮層神經(jīng)元純化培養(yǎng)，細(xì)胞活性良好，純度可達(dá)95％； (3)通過缺血缺氧模型，Hochest33342染色可見皮層神經(jīng)元胞核固縮、碎裂，MTT法檢測細(xì)胞存活率可見通過缺血缺氧后神經(jīng)元存活率下降為(48.82±1.76)％，通過OECs條件培養(yǎng)基預(yù)處理后，神經(jīng)元存活率上升為(78.13±3.09)％。Tunel顯示神經(jīng)元的

8、凋亡率明顯升高為(51.5±5.68％)，經(jīng)過OECs條件培養(yǎng)基預(yù)處理之后，神經(jīng)元的凋亡率較缺血缺氧組明顯減低為(25.83±8.64％)。 (4)統(tǒng)計學(xué)分析表明，OECs條件培養(yǎng)基可以保護(hù)中樞神經(jīng)元，降低死亡率，具有抗凋亡的作用。 結(jié)論： (1)差異貼壁法純化嗅成鞘細(xì)胞簡單易行、費用低廉，增殖迅速，可獲得純度高達(dá)90％以上的OECs； (2) 降低血清濃度和添加阿糖胞苷法進(jìn)行皮層神經(jīng)元純化培養(yǎng)，細(xì)胞活性