抗ATPaseF1單克隆抗體的制備及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文抗ATPaseF1單克隆抗體的制備及其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖及侵襲的影響姓名：王怡波申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：沈鋒20090501碩士學(xué)位論文目的研究人類肝癌中ATPaseFI的表達(dá)情況。制備ATP合成酶F1結(jié)構(gòu)域單克隆抗體，鑒定所得單抗的特異性。詳細(xì)探討ATPaseFI在人類肝癌細(xì)胞株HepG2中的表達(dá)，證實(shí)ATPaseFI在HepG2細(xì)胞株與肝正常細(xì)胞株L02細(xì)胞膜上蛋白表達(dá)的差異，以及研究ATPase

2、Fl抗體對(duì)HepG2細(xì)胞株增殖能力與遷移能力的影響。方法1采用EnVision免疫組織化學(xué)方法檢測38例PLC配對(duì)標(biāo)本中ATPaseFI表達(dá)情況。2提純牛心肌線粒體F1一ATPase，免疫BALB／Cd、鼠。通過雜交瘤技術(shù)，篩選分泌抗hATPaseFl單抗的雜交瘤細(xì)胞株。采用ProteinA親和層析法純化抗體腹水，SDS—PAGE檢測純化產(chǎn)物純度。3利用Westernblot、細(xì)胞免疫熒光、ELISA對(duì)所得單抗特異性進(jìn)行鑒定，單抗亞型檢

3、測ELISA試劑盒檢測單抗亞型。4運(yùn)用蔗糖梯度離心法分離出細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，繼以PIERCEKIT改良法抽提細(xì)胞膜蛋白，抽提產(chǎn)物用COXI單抗驗(yàn)證以排除線粒體膜蛋白的干擾，再以免疫印跡法(Westernblot)檢測HepG2細(xì)胞株與肝正常細(xì)胞株L02細(xì)胞膜上ATPaseFI的蛋白表達(dá)差異。5運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光及流式細(xì)胞技術(shù)證實(shí)ATPaseFI在HepG2細(xì)胞株與肝正常細(xì)胞株L—02細(xì)胞膜上表達(dá)的差異。6利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK8assay)檢

4、測ATPaseFI單抗對(duì)HepG2細(xì)胞生長增殖的影響。利用劃痕愈合試驗(yàn)(Wound—healingassay)和Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)觀察ATPaseFI單抗對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。結(jié)果138例PLC腫瘤組織中ATPaseFl的中高度表達(dá)總計(jì)30例，38例癌旁對(duì)照組織的中高度表達(dá)總計(jì)11例。ATPaseFl蛋白在PLC腫瘤組織的中高度表達(dá)率顯著高于配對(duì)癌旁組織(尺001)。2獲得純化的牛心肌線粒體FIATPase。篩選出

5、了針對(duì)hATPaseFl特異性較強(qiáng)的穩(wěn)定雜交瘤細(xì)胞株5GlO。用間接ELISA法測雜交瘤細(xì)胞5GlO培養(yǎng)上清的抗體滴度為1：104；小鼠腹水的滴度大于1：106。采用ProteinA親和層析法純化腹水抗體，檢測抗體滴度大于l：106，洗脫峰SDS—PAGE鑒定表明純度大于95％。3用SigmaImmunoType硼Kit檢測Mab5GlO屬IgGl型。HepG2細(xì)胞全蛋白和提純的牛心肌線粒體ATPaseFl進(jìn)行Westernblot結(jié)果