利用定向蛋白組學(xué)液質(zhì)串聯(lián)技術(shù)對乳腺癌耐藥相關(guān)膜蛋白的定量分析研究.pdf

1、目的:乳腺癌化療過程中多藥耐藥性的高發(fā)和膜蛋白相關(guān)，其中包括P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin receptor, TfR)。有研究表明P-gp蛋白能夠?qū)⒒熕幬飶娜橄侔┠[瘤細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，它的過度表達(dá)與腫瘤多藥耐藥相關(guān)。TfR蛋白參與鐵的吸收并在細(xì)胞生長和細(xì)胞增殖方面發(fā)揮作用，已有很多文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)TfR蛋白在許多種癌癥包括乳腺癌中過度表達(dá)并且耐藥細(xì)胞和產(chǎn)生耐藥的乳腺癌組織中表達(dá)量

2、更多。準(zhǔn)確定量測定乳腺癌中P-gp蛋白和TfR蛋白的含量將有助于改善腫瘤的早期檢測診斷和預(yù)測乳腺癌患者的化療效果及預(yù)后評估。
　　方法:利用基于LC-MS/MS的定向蛋白組學(xué)液質(zhì)串聯(lián)技術(shù)建立對P-gp蛋白和TfR蛋白定量檢測的方法，用于測定乳腺癌細(xì)胞系和乳腺癌組織中P-gp蛋白和TfR蛋白的含量。
　　結(jié)果:1.434STTVQLMQR442，674GSQAQDR680和368IIDNKPSIDSYSK380這三個(gè)肽段是P-

3、gp蛋白胰蛋白酶水解的特異性肽段，選取434STTVQLMQR442代替P-gp蛋白作為研究目標(biāo)物進(jìn)行定量，建立P-gp蛋白定量檢測MRM條件，采用內(nèi)標(biāo)法用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段STTV*QLMQR為內(nèi)標(biāo)物并準(zhǔn)確測定了乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/WT和乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/ADR中P-gp蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法的結(jié)果進(jìn)行對比，包括激光共聚焦技術(shù)、蛋白免疫印跡和流式細(xì)胞術(shù)。最后，利用建立的定量方法對60對產(chǎn)生化療藥物耐受的

4、乳腺癌病人的癌組織和癌旁組織中的P-gp蛋白含量進(jìn)行了定量檢測。
　　2.選取681VEYHFLSPYVSPK693代替TfR蛋白本身作為研究目標(biāo)物進(jìn)行定量，建立TfR蛋白定量檢測MRM條件，采用內(nèi)標(biāo)法用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段V*EYHFLSPYVSPK為內(nèi)標(biāo)物。質(zhì)量控制數(shù)據(jù)結(jié)果顯示可接受的準(zhǔn)確度和精密度范圍，最后利用建立的方法準(zhǔn)確測定了三個(gè)乳腺癌細(xì)胞系和36對乳腺癌病人的癌組織和癌旁組織中TfR蛋白的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與激光共聚焦技術(shù)

5、、蛋白免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)和組織免疫化學(xué)方法所得結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)論:基于定向蛋白組學(xué)的液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能準(zhǔn)確定量細(xì)胞和臨床組織樣本中的P-gp蛋白和TfR蛋白，并能應(yīng)用于低濃度的臨床樣本的測定。這種方法為將來大規(guī)模測定大分子生物標(biāo)志物提供了一種可能。
　　總而言之，液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜分析手段具有快速經(jīng)濟(jì)、定量限低、靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，尤其是在測定低濃度以及生物樣本時(shí)更能得到較為可靠的數(shù)據(jù)。實(shí)踐證明，液質(zhì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能夠