綠茶提取物光保護(hù)作用系列研究-EGCG干預(yù)UVB輻射后BALB-c小鼠皮膚細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、背景： 紫外線(UV)包括長波紫外線(UVA)、中波紫外線(UVB)和短波紫外線(UVC)是造成人類皮膚結(jié)構(gòu)和功能改變的主要環(huán)境因素。特別是UVB輻射可導(dǎo)致目曬傷，自由基及活性氧的形成，引起細(xì)胞因子產(chǎn)生與分泌，局部及系統(tǒng)免疫抑制，細(xì)胞DNA損傷及突變頻率增加，甚至導(dǎo)致皮膚光老化及皮膚癌腫。 細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在各種因素作用下，由多種凋亡基因調(diào)控的一種主動性細(xì)胞自殺過程，是細(xì)胞的一種死亡方式。細(xì)胞凋亡有其自身的形態(tài)學(xué)、生物化

2、學(xué)的特征，以區(qū)別與細(xì)胞壞死。它是一個程序性過程，需要大量相關(guān)蛋白及轉(zhuǎn)錄因子特異性表達(dá)，并激活核酸酶，將DNA分解成片段，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡與胚胎形成、衰老、損傷細(xì)胞的清除以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)化等病理、生理過程有密切關(guān)系。 腫瘤壞死因子(TNF-α)是一重要的促炎癥細(xì)胞因子，它主要由單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞分泌。它不僅是殺傷腫瘤作用較強(qiáng)的一種生物活性因子，同時(shí)也是一個極其重要的致病因子，參與多種疾病的病理生理過程。TN

3、F-α作用于細(xì)胞膜受體TNFR P55和P75，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、蛋白激酶激活和核轉(zhuǎn)錄因子кB(NF-кB)激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡和炎癥發(fā)生。TNF-к在炎癥反應(yīng)中具有中樞作用，與UVB輻射引起的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。同時(shí)，它還是細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)因子，UVB輻射能劑量依賴性地增加細(xì)胞凋亡對TNF-α的易感性。 TNF-α還參與了UVB誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)凋亡的機(jī)制。 p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路參與細(xì)胞生長與分化

4、，細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)及細(xì)胞死亡等許多生物學(xué)行為過程。紫外線輻射導(dǎo)致的DNA損傷通過信號級聯(lián)反應(yīng)活化ATR/Chkl、jun、p38 MAPK等信號通路，從而導(dǎo)致核苷酸切除修復(fù)(NER)及p53，NF-кB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的修復(fù)過程的啟動。上述過程引起了細(xì)胞內(nèi)非常復(fù)雜的反應(yīng)，啟動DNA損傷的修復(fù)、細(xì)胞周期的活化及細(xì)胞凋亡。UVB輻射可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10等炎癥因子分泌增加，由于p38 MAPK的活化是較為重要

5、的一個環(huán)節(jié)，而且TNF-α在UVB誘導(dǎo)的皮膚細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮主要作用，故UVB輻射導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡及TNF-α增加是否是通過活化p38 MAPK途徑而實(shí)現(xiàn)的有待于證實(shí)。 綠茶作為一種保健品在全世界廣為飲用。近年來，許多研究顯示綠茶具有抗炎和抗癌作用。我們及其他研究者的結(jié)果也顯示在小鼠受UVB輻射前局部外用或在飲水中加入綠茶的主要活性成分表沒食子兒茶素沒食子酸脂(EGCG)可以防止UVB輻射造成的免疫抑制及腫瘤發(fā)生。 盡管

6、許多細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)EGCG具有優(yōu)良的光保護(hù)作用，但在防曬功能上應(yīng)以外用為重?，F(xiàn)在大部分防曬產(chǎn)品都是外用制劑，并以溶液和乳劑為常見。脂質(zhì)體是一種新的賦形劑，具有透皮性好，可形成藥物貯庫等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究UVB輻射對BALB/c小鼠皮膚細(xì)胞凋亡及p38 MAPK通路的活化和TNF-α表達(dá)的影響以及不同劑型EGCG的防護(hù)作用有無差異。 目的： 觀察急慢性UVB輻射后BALB/c小鼠皮膚細(xì)胞凋亡、TNF-α表

7、達(dá)及p38 MAPK通路的活化情況，以及不同劑型EGCG的干預(yù)作用。 材料與方法： 1．實(shí)驗(yàn)動物及分組：雌性BALB/c小鼠，6-8周，于實(shí)驗(yàn)前一天剃去背部毛發(fā)并隨機(jī)分組：Ⅰ：急性損傷組(180 mJ/cm<'2>/單次)：空白對照組、UVB組、UVB+EGCG丙酮溶液組、UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組、UVB+N酮溶液組、UVB+乳膏基質(zhì)組、UVB+空脂質(zhì)體組，每組6只；Ⅱ：慢性損傷組(30 mJ/c

8、m<'2>/日)：組內(nèi)處理同前。 2．各劑型EGCG配置：EGCG配成濃度為10mg/mL的丙酮溶液、乳膏、脂質(zhì)體4℃保存。取EGCG250mg，加丙酮至25ml，制成10mg/mlEGCG丙酮溶液。取EGCG250mg，加入硬脂酸，單硬脂酸甘酯，液狀石蠟，羥苯乙酯，乳化劑，甘油，制成10mg/ml EGCG乳劑(O/W)備用。以大豆卵磷脂、膽固醇為膜材，采用逆相蒸發(fā)法制備得到EGCG脂質(zhì)體，卵磷脂/膽固醇(摩爾比)為2：1，E

9、GCG濃度為10 mg/ml，包封率可達(dá)70％。顯微鏡下觀察到了脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。平均粒徑為327nm，制備的脂質(zhì)體經(jīng)室溫放置1月，包封率和粒徑無明顯改變(由東南大學(xué)化學(xué)系配制)。 3．實(shí)驗(yàn)動物處理：給藥劑量為每平方厘米皮膚外用1mgEGCG(即1mg/cm<'2>)。于小鼠背部皮膚局部外用相應(yīng)藥物后半小時(shí)予不同劑量的UVB輻射，急性損傷組予180mJ/cm<'2>UVB單次輻射，24h后處死小鼠取背部皮膚，慢性損傷組予30mJ/cm

10、<'2>UVB輻射，每日1次，連續(xù)30天，最后一次輻射后24h處死小鼠取背部皮膚，液氮冷凍保存。 4．小鼠皮膚細(xì)胞凋亡檢測：取小鼠背部皮膚，制作石蠟組織切片，TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。 5．小鼠皮膚細(xì)胞TNF-α含量檢測：小鼠皮膚組織勻漿后取上清，ELISA法檢測TNF-α的表達(dá)。 6．小鼠皮膚p38 MAPK磷酸化水平檢測：提取組織總蛋白，WesternBlotting法測定p38及pp38蛋白表達(dá)，觀察條帶

11、，凝膠成像系統(tǒng)掃描處理。 結(jié)果： 1．急性損傷組(180mJ/cm<'2>/單次) (1)由于UVB輻射劑量較大，照光組中皮膚細(xì)胞大部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，UVB組的凋亡指數(shù)(Apoptotic Index，AI)是空白對照組的126.89倍。與單純UVB組相比，UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組、UVB+丙酮溶液組、UVB+乳膏基質(zhì)組、UVB+空脂質(zhì)體組凋亡指數(shù)仍較高，且均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；

12、而UVB組凋亡指數(shù)是UVB+EGCG丙酮溶液組的23.169倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (2)UVB組TNF-α水平與空白對照組相比升高了1.99倍；與單純UVB組相比，UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組、UVB+丙酮溶液組、UVB+乳膏基質(zhì)組、UVB+空脂質(zhì)體組TNF-α的檢測水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而UVB組TNF-α的表達(dá)水平是UVB+EGCG丙酮溶液組的2.54倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

13、P<0.05)。 (3)各組總p38蛋白表達(dá)水平差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與空白對照組相比，UVB組pp38蛋白的表達(dá)水平增加了2.06倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與UVB組相比，UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組、UVB+丙酮溶液組、UVB+乳膏基質(zhì)組、UVB+空脂質(zhì)體組pp38蛋白的表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而UVB組pp38蛋白的表達(dá)水平是UVB+EGCG丙酮溶液組的2.5

14、1倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 2.慢性損傷(30mJ/cm<'2>/日)組 (1)各處理組的凋亡指數(shù)與空白對照組相比均有增高；與單純UVB輻射組相比，UVB+EGCG丙酮溶液組、UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組分別增高了1.4、5.60及5.77倍；UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組的增高程度更為顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (2)與空白對照組相比，各組TN

15、F-α的表達(dá)水平均有增高；與單純UVB輻射組相比，各加藥組TNF-α表達(dá)水平的增高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，UVB+EGCG丙酮溶液組、UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組分別增高了27.64％、65.87％及60.21％；UVB+EGCG乳膏組和UVB+EGCG脂質(zhì)體組的增高程度更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 (3)各組總p38蛋白表達(dá)水平差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但各組pp38蛋白的表達(dá)水平與空白

16、對照組相比均有增高；與單純UVB輻射組相比，UVB+EGCG丙酮溶液組、UVB+EGCG乳膏組、UVB+EGCG脂質(zhì)體組分別增高了1.04、3.43及3.32倍；UVB+EGCG乳膏組和UVB+EGCG脂質(zhì)體組的增高程度更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： 急慢性UV3輻射均可導(dǎo)致BALB/c小鼠皮膚細(xì)胞發(fā)生凋亡，TNF-α表達(dá)增加及p38 MAPK磷酸化水平增高。EGCG在急慢性UVB輻射中表現(xiàn)出不同作