2型糖尿病患者M(jìn)BL及相關(guān)細(xì)胞因子變化的研究.pdf

1、目的：2型糖尿病是一種自身免疫和低度炎癥性疾病，且2型糖尿病存在著細(xì)胞因子介導(dǎo)的急性相反應(yīng)，細(xì)胞因子可通過(guò)多種機(jī)制引起炎癥反應(yīng)，最終引起或加速糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生。甘露（聚）糖結(jié)合凝集素(mannose-binding lectin，MBL)是一種主要由肝臟合成的急性時(shí)相蛋白，在天然免疫中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MBL水平與多種疾病有關(guān)，MBL缺失或含量低下可增加感染性疾病的易感性和感染的嚴(yán)重程度。本研究的主要目的是調(diào)查糖尿病人與健康

2、人血漿MBL、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量變化和MBL基因Exon I54位密碼子基因突變的頻率，并分析其變化情況，從固有免疫的角度探討糖尿病的可能致病機(jī)制，為進(jìn)一步探討MBL和細(xì)胞因子在糖尿病發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制及其在糖尿病治療中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.標(biāo)本的收集與處理收集131例2型糖尿病患者空腹靜脈血，100例健康對(duì)照者空腹靜脈血，均為全血標(biāo)本(EDTA-K2)，分離血漿與細(xì)胞成分，

3、血漿用于MBL、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量測(cè)定，細(xì)胞成分用于提取DNA。
　　 2.DNA提取及MBL基因突變分析采用低滲溶解法溶解紅細(xì)胞，提取白細(xì)胞，再用鹽酸胍法提取白細(xì)胞中DNA。用PCR-RFLP法檢測(cè)MBL基因ExonI54位密碼子突變基因，擴(kuò)增體系為25μL，其中10×Buffer2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2.0μL，Primerl(50μmol/L)0.2μL,Primer2(50

4、μmol/L)0.2μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.25μL，模板2.0μL，滅菌三蒸水補(bǔ)至25μL。擴(kuò)增參數(shù)為：預(yù)變性95℃5min;95℃45s、55℃45s，72℃1min，循環(huán)30次；末延伸72℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用TAE配制含0.5μg/ml溴化乙啶2％的瓊脂糖凝膠電泳，加樣5μL/孔，電泳30min;PCR Marker作為參照，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶(BshN I)酶切：酶切體系為31μL，

5、其中：BshNI(10u/μL)0.5μL，10×Buffer2μL，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物10.0μL，滅菌三蒸水18.5μL，37℃水浴反應(yīng)大于3小時(shí)，酶切產(chǎn)物用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳分析。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理后比較DM組和健康對(duì)照組MBL ExonI54位密碼子點(diǎn)突變頻率是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 3.血漿中細(xì)胞因子檢測(cè)采用ELISA法測(cè)定標(biāo)本血漿中MBL、IL-6、IL-8、IL-17、IL-23含量。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理分析，比較DM

6、患者組和健康對(duì)照組血漿細(xì)胞因子含量是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.MBL基因突變分析：應(yīng)用PCR-RFLP法對(duì)提取的標(biāo)本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用BshNI酶切后電泳出現(xiàn)三種情況：顯示一條帶，DNA片斷大小為330bp;顯示兩條帶，對(duì)應(yīng)的DNA片斷大小分別為236bp和94bp;顯示三條帶，對(duì)應(yīng)的DNA片斷大小分別為330bp、236bp和94bp，三種情況分別代表54位密碼子為純合突變型、野生型和雜合突變

7、型，不同類型標(biāo)本酶切后電泳結(jié)果與測(cè)序結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出MBL基因ExonI54密碼子基因在DM患者突變(GAC)頻率為14.5％，正常對(duì)照組突變頻率為17％。
　　 2.血漿MBL含量及細(xì)胞因子測(cè)定結(jié)果：DM組MBL的含量為1840±602μg/L，健康對(duì)照組MBL的含量為2003±718μg/L，兩組相比t=-1.867，P=0.063＞0.05;DM組IL-6的含量為505±212ng/L，健康對(duì)照組IL-6的含量為43

8、6±231ng/L，兩組相比t=2.336，P=0.02＜0.05;DM組IL-8的含量為1030±365ng/L，健康對(duì)照組IL-8的含量為945±600ng/L，兩組相比t=1.333，P=0.184＞0.05;DM組IL-17的含量為257±135ng/L，健康對(duì)照組IL-17的含量為138±66ng/L，兩組相比t=8.101，P=0.000＜0.01;DM組IL-23的含量為2316±952ng/L，健康對(duì)照組IL-23的含量

9、為1958±1326ng/L，兩組相比t=2.389，P=0.018＜0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.糖尿病組血漿IL-6和健康對(duì)照組相比升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；糖尿病組血漿IL-8和健康對(duì)照組相比略高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；糖尿病組血漿IL-17和健康對(duì)照組相比明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；糖尿病組血漿IL-23和健康對(duì)照組相比升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 2.