過熱復(fù)合脂多糖致熱射病大鼠動物模型多器官急性損傷的實驗研究.pdf

1、熱射病為重癥熱損傷，主要臨床表現(xiàn)為體核溫度驟升，出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，可導(dǎo)致休克、靶器官損傷以及多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），其發(fā)病率及病死率可能隨著全球氣候變暖以及熱浪襲擊頻率和強度的逐年增加而上升。熱射病代謝改變及組織損傷的介導(dǎo)機制至今未明。前期研究顯示，過熱與外源性內(nèi)毒素（脂多糖，lipopolysaccharides，LPS）復(fù)合打擊可促發(fā)和加重炎癥反應(yīng)

2、，造成急性肺損傷。 目的：運用過熱與脂多糖復(fù)合打擊技術(shù)復(fù)制重度熱射病大鼠的動物模型，監(jiān)測該模型心、肺、腦、肝、腎、骨骼肌等組織的病理生理損傷特點，探討重度熱射病、MODS的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）啟動途徑的特征，為重度熱射病嚴密監(jiān)護及發(fā)病機制方面的深入研究提供依據(jù)，以期縮短病程、改善預(yù)后。 材料與方法： 實驗設(shè)計2（干球溫度（T

3、d），2水平：（35.0±0.5）℃、（26.0±0.5）℃）×2（藥物（Dr），2水平：LPS、注射用生理鹽水（NS））×4（應(yīng)激時間（Tm），4水平：0min、40min、80min、120min）析因設(shè)計，隨機對照實驗。 實驗環(huán)境: 南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶衛(wèi)生學(xué)學(xué)院仿真氣候室動物艙。 實驗對象: 無特殊病原體動物（Special pathogen free animal，SPF動物）級雄性Wistar大鼠96只

4、，體質(zhì)量（190～210）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。 處理: （1）將80只大鼠隨機分為4大組，即常溫生理鹽水應(yīng)激組（C組）、高溫NS應(yīng)激組（H組）、常溫LPS應(yīng)激組（L組）、高溫+LPS應(yīng)激組（HL組），各大組下設(shè)應(yīng)激后0min、40min、80min、120min亞組，每組5只動物（n=5）。以3%戊巴比妥鈉1ml/kg腹腔注射麻醉動物，L組、HL組動物經(jīng)尾靜脈注射LPS10mg/kg（Escherichia

5、 coli，0111：B4，1mg/ml），C組、H組動物經(jīng)尾靜脈注射NS 10ml/kg。將動物置入仿真熱氣候室動物艙行熱暴露。H組、HL組動物暴露條件：Td：（35.0±0.5）℃，濕球溫度（Tw）：（27.0±0.5）℃；C組、L組動物暴露條件：Td：（26.0±0.5）℃，Tw：（21.0±0.5）℃，各實驗組動物暴露環(huán)境相對濕度（RH）均為（40±5）%； （2）16只接受熱應(yīng)激大鼠隨機分2組（n=8）：H組、HL組，

6、麻醉、暴露溫度及藥物處理同前，暴露100min后置于Td：（26.0±0.5）℃，Tw：（21.0±0.5）℃環(huán)境自主恢復(fù)。 主要終點指標: （1）熱應(yīng)激反應(yīng)的指標：①持續(xù)監(jiān)測應(yīng)激動物生命體征（直腸溫度（rectal temperature，Tr）），心率（heart rate，HR），動脈收縮壓（systolic arterial pressure，SAP），呼吸頻率（respiratory rate，RR）的動態(tài)變化

7、；②16只接受熱應(yīng)激大鼠的熱應(yīng)激反應(yīng)：熱負荷（heat load）、熱速率（heat rate）、SAP的最高值（SAP max）及最低值（SAP mix）、動物從接受熱暴露至發(fā)生熱射病的時間（stroke time，Tst）以及發(fā)生熱射病后的存活時間（survival time，Tsr）； （2）生化指標：于0min、40min、80min、120min時相點，檢測：①外周血血小板計數(shù)（peripheric platelet

8、count，PLT），血漿活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin，aPTT），凝血酶原時間（prothrombin time，PT），紅細胞比容（hematocrit，Hct）以及②血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotrasferase，ALT）、天門冬酸轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、肌酐（creatinine，Cr）、尿素氮（blo

9、od urea nitrogen，BUN）含量的變化； （3）細胞因子水平檢測：采用固相三明治夾心、酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法檢測0min、 40min、80min、120min時相點①血漿白細胞介素-10 （Interleukin-10，IL-10），白細胞介素-8（Interleukin-8，IL-8），白細胞介素-1受體拮抗劑（Interleukin-

10、1 receptor antagolust，IL-1ra）、可溶性TNF受體Ⅰ、Ⅱ（soluble Tumor Necrosis Factor Ⅰ and Ⅱ）及②肝、腎、脾、腎上腺組織炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）含量； （4）組織學(xué)檢查：120min時各

11、組動物心、肺、腦、肝、腎、脾、骨骼肌等組織HE染色光鏡觀察（HL組各時相點均查）；免疫組織化學(xué)法觀察應(yīng)激120min時各組動物心、肺、腦、肝、腎、脾、骨骼肌等組織TNF-α染色。 統(tǒng)計學(xué)分析計量資料數(shù)據(jù)用x±s表示，運用SPSS for Windows軟件包（13.0版本，南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)院生物統(tǒng)計系提供），采用析因分析（analysis of variance，ANOVA）進行不同溫度、時間、藥物水平各監(jiān)測指標

12、間差異的主效應(yīng)分析，固定時間水平，進行各指標的單因素方差分析（ony-way ANOVA），均數(shù)間多重比較用最小有意義差異（least significant difference，LSD）t檢驗。H/HL組間Tst以及Tsr的均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗（independent-sample t test）。認為P≤0.05為顯著性水準。 結(jié)果： 主效應(yīng)的方差分析表明，不同時間水平動物生命體征及血漿PLT、aPTT、PT

13、、血清ALT、AST、BUN、血漿IL-1ra、sTNFrⅠ/Ⅱ、IL-8、IL-10、肝及脾組織TNF-α、IL-6、IL-1β、腎組織TNF-α、腎上腺組織TNF-α、IL-6含量均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；不同溫度水平存在顯著性差異的指標包括生命體征及血漿PLT、aPTT、PT、血清ALT、AST、BUN、血漿IL-1ra、sTNFrⅠ、IL-8、脾組織TNF-α、IL-6、IL-1β、肝及腎上腺組織TNF-α、IL-6、腎

14、組織TNF-α含量（P<0.05）；不同藥物水平存在顯著性差異的指標包括生命體征中的HR、SAP及血漿PLI、aPTT、PT、血清AST、BUN、血漿IL-1ra、sTNFrⅠ/Ⅱ、IL-8、IL-10、脾組織TNF-α、IL-6、IL-1β、肝及腎上腺組織TNF-α、IL-6含量。固定溫度、藥物水平，不同時相點各指標單向方差分析（one-way ANOVA）表明（以LSD做后續(xù)檢驗）： （1）熱應(yīng)激反應(yīng)。 （2）生化指

15、標： PLT、aPTT、PT、ALT、AST、Urea。 （3）炎癥介質(zhì)水平： 循環(huán)炎癥介質(zhì)、組織炎癥介質(zhì)、腎組織炎癥介質(zhì)、腎上腺炎癥介質(zhì)、脾組織炎癥介質(zhì)。 （4）組織病理學(xué)改變： 120min時，HE染色光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，LPS與高溫復(fù)合打擊動物的心、肺、腦、肝、腎、脾、骨骼肌等組織出現(xiàn)病理損傷，程度重于比L/H組： 心組織學(xué)改變、腦組織學(xué)改變、肺組織學(xué)改變、肝組織學(xué)改變、腎組織學(xué)改變、脾組

16、織學(xué)改變、骨骼肌組織學(xué)改變、小腸組織學(xué)改變。 結(jié)論： 1.本研究首次發(fā)現(xiàn)，高溫與LPS同時打擊可以復(fù)制重度熱射病大鼠多器官急性損傷的動物模型。從炎癥反應(yīng)角度講，動物的反應(yīng)與人由中度熱射病發(fā)展為重度熱射病的反應(yīng)具有相似性、重復(fù)性。動物熱應(yīng)激反應(yīng)（如生命體征、熱負荷及熱速率）、循環(huán)衰竭及多器官急性損傷等表現(xiàn)與人重度熱射病的臨床表現(xiàn)相近。該模型可用于重度熱射病炎癥反應(yīng)途徑啟動機制、評價治療及重癥監(jiān)護措施對重度熱射病病程及預(yù)后影

17、響的進一步研究。 2.內(nèi)毒素血癥在從熱射病向重度熱射病發(fā)展進程中起重要作用。熱應(yīng)激下內(nèi)毒素血癥可通過SIRS途徑造成生命體征、凝血-抗凝血平衡紊亂，使炎癥介質(zhì)表達異常，促使熱應(yīng)激個體出現(xiàn)循環(huán)衰竭、重度熱射病甚至多器官急性損傷。 3.復(fù)合打擊可促發(fā)和加重全身炎癥反應(yīng)綜合征，表現(xiàn)為血漿細胞因子IL-1ra、sTNFrⅠ/Ⅱ）、IL-8、IL-10及組織細胞因子TNF-α、IL-1α、IL-6含量顯著升高。這些細胞因子在調(diào)節(jié)局