人根尖乳頭干細胞和牙髓干細胞生物行為的比較研究.pdf

1、目的:
　　 Gronthos S等發(fā)現(xiàn)牙髓組織中存在干細胞(dental pulp stem cells_,DPSCs)。該細胞具有強增殖性、多向分化的潛能,在體外誘導可向成牙本質(zhì)樣細胞分化。同時,將DPSCs植入免疫缺陷鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)有牙本質(zhì)樣基質(zhì)形成；最近Sonoyama等研究發(fā)現(xiàn)在根尖乳頭組織中存在干細胞,命名為根尖乳頭干細胞(Stem cell from the apical papilla,SCAP),并證明這類細胞是

2、與牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)不同類型的細胞。本實驗目的是體外培養(yǎng)人根尖乳頭細胞,經(jīng)地塞米松礦化誘導,誘導礦化結(jié)節(jié)的形成及DSP和其他相關(guān)蛋白的表達,同時將腫瘤壞死因子α(TNF-α)對其進行干預,觀察其對礦化過程及牙本質(zhì)樣細胞形成的影響,探討炎癥條件下根尖乳頭細胞用于牙本質(zhì)再生的可行性。同時與同一牙的牙髓細胞進行比較研究。
　　 方法:
　　 取18歲以下根尖未發(fā)育完成的健康阻

3、生第三磨牙,用Ⅰ型膠原酶和Dispase消化法進行根尖乳頭細胞和牙髓細胞的培養(yǎng),細胞達到匯合后進行傳代,取第3～5代細胞用于實驗。
　　 1.取第3代細胞,將根尖乳頭細胞、牙髓細胞以1×104個/mL的細胞懸液,分別接種于預先放置有細胞爬片的6孔板中,用免疫熒光方法鑒定細胞的間充質(zhì)干細胞表面標記物STRO-1的表達。
　　 2.將根尖乳頭細胞、牙髓細胞分別以1×104個/mL接種于96孔板中,孵育4d后,采用MTT法檢測

4、細胞的增值狀況。
　　 3.將根尖乳頭細胞、牙髓細胞分別以1×103個/mL接種于24孔板中,細胞大部分伸展貼壁后,加入礦化誘導液,孵育28d后,茜素紅S染色法檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況,免疫組化法檢測牙本質(zhì)特異性蛋白DSP、礦化相關(guān)蛋白BSP表達情況。
　　 4.將根尖乳頭細胞、牙髓細胞分別以1×104個/mL接種于96孔板中,24h后將含有不同濃度TNF-α(5、10、50 ng/mL)的培養(yǎng)液加入,孵育4d后,MTT法檢

5、測其對細胞增殖活性的影響。
　　 5.將根尖乳頭細胞、牙髓細胞分別以1×103個/mL接種于24孔板中,細胞大部分伸展貼壁后,加入含有TNF-α的礦化誘導液,孵育28d后,茜素紅S染色法檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況,免疫組化法檢測牙本質(zhì)特異性蛋白DSP、礦化相關(guān)蛋白BSP表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)的根尖乳頭細胞呈梭形、多角形或紡錘形,形似成纖維細胞。牙髓細胞也似成纖維細胞,形狀與根尖乳頭細胞相似。免疫熒

6、光技術(shù)表明,部分細胞STRO-1染色陽性。
　　 2.MTT法結(jié)果表明,APCS較之DPCS具有更強的增值活性(P<0.05)。
　　 3.礦化液體外誘導,根尖乳頭細胞和牙髓細胞疊層生長,形成肉眼可見的結(jié)節(jié)；茜素紅S染色,有橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成:免疫組織化學染色技術(shù)顯示,細胞誘導28d后,牙本質(zhì)特異性蛋白DSP、礦化相關(guān)蛋白BSP陽性表達。
　　 4.在10ng/mL和50ng/mL兩個濃度時,TNF-α對根尖乳頭

7、細胞、牙髓細胞兩種細胞的增值均具有促進作用(P<0.05)。
　　 5.用含有TNF-α的礦化液誘導,根尖乳頭細胞和牙髓細胞在較早的時間便有肉眼可見的結(jié)節(jié)形成。茜素紅S染色顯示,有橘紅色礦化結(jié)節(jié)形成；免疫組織化學染色技術(shù)顯示,細胞在炎性因子的誘導28d后,DSP、BSP陽性表達。
　　 結(jié)論:
　　 體外培養(yǎng)的根尖乳頭細胞形似成纖維細胞,STRO-1表達陽性；人根尖乳頭較牙髓細胞具有較強的增殖活性,在炎性環(huán)境下也