實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)CML患者HMGA2基因表達(dá)的研究.pdf

1、研究背景和目的 HMGA2是高遷移率蛋白(highmobilitygroup，HMG)家族成員，是一種小分子核染色質(zhì)結(jié)合蛋白。HMG家族因其成員分子量較小，可在聚丙烯酰胺凝膠電泳中快速遷移而得名。其蛋白氨基端含有3個(gè)短的基礎(chǔ)重復(fù)序列編碼結(jié)構(gòu)域，能與DNA分子小溝內(nèi)的A-T豐富區(qū)結(jié)合，稱(chēng)之為AT-hooks結(jié)構(gòu)。HMGA2本身沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，但可作為構(gòu)筑因子，與DNA結(jié)合并改變其空間結(jié)構(gòu)，通過(guò)復(fù)雜的蛋白.DNA、蛋白.蛋白相互作用網(wǎng)

2、絡(luò)，統(tǒng)籌核蛋白復(fù)合物的裝配，從而調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄。 HMGA2在人體正常生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用。胚胎發(fā)育過(guò)程中，各組織廣泛且高表達(dá)HMGA2，而在大多數(shù)正常成人組織則無(wú)表達(dá)或低表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，多種良惡性腫瘤包括血液系統(tǒng)腫瘤均存在HMGA2過(guò)度表達(dá)或基因重排后的異常表達(dá)，引起了人們對(duì)HMGA2在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起作用的關(guān)注。多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示了HMGA2的致癌活性，而阻斷其表達(dá)則可能抑制腫瘤生成。例如在逆轉(zhuǎn)錄病毒作用后的鼠甲狀

3、腺細(xì)胞中，只有發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中能測(cè)得HMGA2表達(dá)；在表達(dá)全長(zhǎng)或截短型HMGA2的轉(zhuǎn)基因小鼠中可觀察到數(shù)種良性腫瘤生成；在鼠甲狀腺細(xì)胞株FRTL5中轉(zhuǎn)染HMGA2反義載體，再與骨髓增殖性肉瘤病毒或柯斯頓鼠肉瘤病毒等作用后發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染反義載體或轉(zhuǎn)染正常HMGA2的細(xì)胞相反，細(xì)胞未能在軟瓊脂培養(yǎng)基上增殖，也未能在裸鼠中轉(zhuǎn)化成腫瘤。 目前認(rèn)為，HMGA2參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制包括：①抑制DNA修復(fù)系統(tǒng)激活，包括與核苷酸切除修復(fù)基

4、因ERCC1的啟動(dòng)子結(jié)合并抑制其活性、直接抑制DNA雙鏈斷裂的修復(fù)信號(hào)通路的激活等。②通過(guò)多種途徑干擾正常細(xì)胞周期，如與pRB/E2F1復(fù)合物結(jié)合，通過(guò)替換組蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)，增強(qiáng)E2F1及DNA結(jié)合組蛋白乙酰化，誘導(dǎo)并增強(qiáng)E2F1活性，促使細(xì)胞進(jìn)入S期并增殖。⑧通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)作用誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。最近研究發(fā)現(xiàn)，可由TGF-β通過(guò)smad途徑誘導(dǎo)HM

5、GA2從而觸發(fā)EMT。④染色體重排導(dǎo)致HMGA2的3'-非翻譯區(qū)(3'untranslatedregion，3'UTR)缺失。截短型HMGA2失去其位于3'UTR的多標(biāo)記位點(diǎn)，無(wú)法與let-7等microRNAs結(jié)合，從而失去microRNA對(duì)HMGA2表達(dá)的抑制作用，最終誘發(fā)腫瘤。 HMGA2在血液系統(tǒng)腫瘤中研究較少，最初有學(xué)者利用常規(guī)RT-PCR方法在慢性髓系白血病及急性髓系白血病患者的外周血、健康志愿者及上述患者的CD34

6、陽(yáng)性造血干細(xì)胞中檢測(cè)到HMGA2表達(dá)，研究者認(rèn)為HMGA2在白血病患者中的表達(dá)可能是由于異常造血干細(xì)胞增殖導(dǎo)致，并有可能成為檢測(cè)某些類(lèi)型白血病的敏感標(biāo)志。染色體12q13-15區(qū)重排在發(fā)生Richter轉(zhuǎn)化的慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、骨髓纖維化伴骨髓化生、骨髓增生異常綜合征、急性髓系白血病等患者中有報(bào)道，利用FISH等研究發(fā)現(xiàn)存在涉及HMGA2的重排，進(jìn)一步觀察認(rèn)為發(fā)生HMGA2重排的患者大多數(shù)預(yù)后不佳。最近Meyer等首

7、次定量檢測(cè)了CML患者HMGA2基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在1例CML加速期(CML-acceleratedphase，AP)及1例急變期(CML-blasticphase，BP)患者中，HMGA2基因表達(dá)水平與慢性期(CML-chronicphase，CP)患者相比較高，推測(cè)可能是由于白血病細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致。 CML是起源于多能造血干細(xì)胞的惡性增殖性疾病，費(fèi)城染色體及bcr/abl融合基因?yàn)槠鋹盒钥寺?biāo)志。t(9;22)(q34;q1

8、1)染色體異位形成bcr/abl融合基因。目前認(rèn)為，bcr/abl融合基因編碼的P210蛋白具有異常增高的酩氨酸激酶活性，可導(dǎo)致下游一系列信號(hào)持續(xù)磷酸化，產(chǎn)生造血干細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻、黏附功能缺陷等病理生理改變，是CML發(fā)病的主要原因。CML發(fā)病可分為CP、AP及BP，CML-CP病情較為隱匿，而進(jìn)入AP/BP后，患者往往對(duì)治療反應(yīng)差，病情進(jìn)展迅速。CML急變往往伴有bcr/abl融合基因表達(dá)增高，PTK活性增強(qiáng)。急變機(jī)制目前仍未完

9、全清楚，現(xiàn)普遍認(rèn)為，CML，急變涉及基因組不穩(wěn)定性、分化障礙、端粒縮短及抑癌基因失活等，是一個(gè)涉及多基因、多途徑的復(fù)雜過(guò)程。 為了探討HMGA2與CML發(fā)展過(guò)程的聯(lián)系，我們選取處于不同進(jìn)展時(shí)期的CML患者外周血為研究對(duì)象，采用TaqMan探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)HMGA2的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析。 研究方法： (一)實(shí)驗(yàn)材料收集2006年1月至2008年2月南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院血液科的24例CML患者外周血

10、標(biāo)本。24名患者中位年齡39.5歲(18-63)，男性14例，女性10例。其中CML-CP12例，CML-AP/BP12例。5份正常對(duì)照外周血標(biāo)本取自南方醫(yī)院檢驗(yàn)科。 (二)實(shí)驗(yàn)方法1.骨髓血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查及染色體核型分析。 2.FISH檢測(cè)bcr/abl融合基因陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HMGA2基因的轉(zhuǎn)錄水平。 ①分別設(shè)計(jì)和合成HMGA2及內(nèi)參照基因GAPDH的引物及探針。

11、②患者外周血標(biāo)本采集和外周血中單個(gè)核細(xì)胞提取。 ③單個(gè)核細(xì)胞中RNA提取。 ④逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。 ⑤常規(guī)PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。 ⑥實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法相對(duì)定量檢測(cè)HMGA2基因轉(zhuǎn)錄水平。 (三)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析根據(jù)數(shù)據(jù)資料性質(zhì)，CML-CP與CML-AP/BP患者HMGA2轉(zhuǎn)錄水平差異利用秩和檢驗(yàn)比較，HMGA2轉(zhuǎn)錄水平和bcr/abl融合基因水平相關(guān)性分析采用Spearman方

12、法：HMGA2轉(zhuǎn)錄水平和患者外周血白細(xì)胞及原幼細(xì)胞水平相關(guān)性分析采用Spearman方法。P≤0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 研究結(jié)果： 1.CML-AP/BP患者HMGA2的轉(zhuǎn)錄水平與CML-CP患者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.157，P<0.01)。CML-CP患者與正常對(duì)照者轉(zhuǎn)錄水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-1.160，0.246)。 2.CML患者HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與bcr/abl融合基因水平之間不存在

13、正相關(guān)關(guān)系(rs=0.078；p=0.471)。其中CML-AP/BP患者HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與bcr/abl也沒(méi)有相關(guān)關(guān)系(rs=0.058；P=0.736)。 3.CML患者HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與其外周血白細(xì)胞數(shù)無(wú)相關(guān)關(guān)系(rs=-0.067；P=0.654)。而在CML-AP/BP患者中，HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與外周血原幼細(xì)胞數(shù)(通過(guò)外周血血常規(guī)白細(xì)胞數(shù)與血涂片原幼細(xì)胞百分比的乘積表示)呈正相關(guān)關(guān)系(rs=0.636；P=0.01

14、7)。 初步結(jié)論： 1.HMGA2基因轉(zhuǎn)錄水平與CML疾病進(jìn)展時(shí)期相關(guān)，CML-AP/BP患者轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CML-CP患者。說(shuō)明HMGA2可能在CML疾病進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 2.HMGA2基因轉(zhuǎn)錄水平與bcr/abl陽(yáng)性細(xì)胞百分比之間無(wú)相關(guān)關(guān)系，提示在CML疾病進(jìn)展過(guò)程中，HMGA2與bcr/abl可能通過(guò)不同途徑發(fā)揮作用。 3.CML-AP/BP患者中，HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與

15、外周血原幼細(xì)胞水平呈正相關(guān)關(guān)系。提示HMGA2表達(dá)可能和CML原始幼稚細(xì)胞增殖有關(guān)，是否可用以監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，觀察治療效果，判斷預(yù)后還有待進(jìn)一步研究。 創(chuàng)新點(diǎn)： 目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)CML患者HMGA2轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對(duì)定量分析，得出部分新的結(jié)論：CML-AP/BP患者HMGA2轉(zhuǎn)錄水平顯著高于CML-CP患者；HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與bcr/abl陽(yáng)性細(xì)胞百分比無(wú)相關(guān)關(guān)系，CML-AP/BP患者中，HMGA2轉(zhuǎn)錄水平與外周血原