基于凝膠固定技術(shù)基因芯片的優(yōu)化及其在孤獨癥SNP研究中的應用.pdf

1、孤獨癥譜障礙(ASDs)是一種是由遺傳和非遺傳因素共同造成的廣泛發(fā)育障礙綜合征，一般在3歲之前發(fā)病，主要特征表現(xiàn)為以下3個方面的行為異常：1)社會交往障礙；2)語言交流技巧障礙：3)重復刻板的動作和單一興趣。遺傳因素對兒童孤獨癥影響很大，一些研究資料表明，與腦部發(fā)育或調(diào)控神經(jīng)分化相關(guān)基因的缺陷是該疾病的影響因素之一。 另一方面，隨著人類基因組序列的繪制完成，后基因組時代的到來，解讀基因的功能和研究基因的多態(tài)性已經(jīng)成為目前人類基因

2、組研究的重點，生命科學領(lǐng)域的研究熱點正迅速轉(zhuǎn)向?qū)蚬δ?、表達調(diào)控、多個基因間以及基因和環(huán)境間相互作用等方面。同時，作為第三代遺傳標記的單核苷酸多態(tài)性(SNP)憑借其數(shù)量多、密度大、分布廣等特點成為對基因組序列研究的重要內(nèi)容之一，在疾病基因的定位與克隆、關(guān)聯(lián)分析等，并在疾病的早期診斷、預防和治療等方面體現(xiàn)重要功能和應用價值。 本論文是利用基于凝膠固定的基因芯片技術(shù)，將SNP的檢測應用于兒童孤獨癥易感基因的研究中，同時對該檢測技術(shù)

3、的穩(wěn)定和準確性進行優(yōu)化，主要內(nèi)容如下： 1．基于凝膠固定基因芯片技術(shù)的優(yōu)化 實驗探討了丙烯酰胺聚合反應時間對芯片SNP分型的影響問題。比較了0分鐘、5分鐘、15分鐘、50分鐘的聚合發(fā)生時間的雜交分型結(jié)果。結(jié)果表明，固定聚合時間為30-50分鐘時，固定效果較好。過短的固定聚合時間會對后續(xù)的雜交效果產(chǎn)生影響，例如背景噪聲過高，點陣偏綠等。 在雜交探針方面，我們對實驗使用的探針進行了統(tǒng)計和效果分析。雖然探針的長度都在1

4、3nt左右，但由于其C/G含量不同，Tm值也有差別。從雜交的結(jié)果圖中可以看到，Tm值過低或是過高，不僅會影響到雜交結(jié)果圖像的質(zhì)量，同時也會造成對點陣錯誤的分型。我們對探針的選擇作了進一步的要求，選擇Tm值在34℃-40℃的探針，保證雜交結(jié)果的準確和清晰，并統(tǒng)一大批量實驗的雜交溫度標準。 2．基于凝膠固定平臺的SNP檢測技術(shù)應用于兒童孤獨癥候選易感基因的分型 根據(jù)近期國內(nèi)外文獻資料，結(jié)合實驗室前期實驗開發(fā)的本地數(shù)據(jù)庫，我們

5、初步篩選了GABA系統(tǒng)的GABRB1、GABRB2、GABRA2基因上的5個SNP位點進行SNP的分型檢測(rs2351299，rs3832300，rs2617503，rs12187676，rs2119767)。實驗選取了南京腦科醫(yī)院提供的500例樣本資料，共涵蓋了126個核心家系和120例正常對照。 3．分析SNP分型結(jié)果與兒童孤獨癥的相關(guān)性 所有位點的分型結(jié)果通過Hardy-Weinberg平衡檢驗，樣本具有群體代表

6、性，并采用case-control和傳遞不平衡的方法進行統(tǒng)計和遺傳學分析。研究得到了以下結(jié)果：(1)SNP位點rs2351299 G/G基因型的傳遞與語言遲緩、語言倒退、強迫癥、兒童孤獨癥評定量表(CARS值)相關(guān)(P<0.05)； (2)位點rs3832300的-/-基因型與刻板動作、兒童孤獨癥評定量表(CARS值)，-/T基因型與多動癥狀相關(guān)；(3)位點rs2617503的A/A基因型的傳遞與智商、運動協(xié)調(diào)性障礙、刻板動作這些癥狀相