VSMC BKCa活性改變與衰老相關基因p16、p21關系的研究.pdf

1、目的：觀察動脈平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)大電導鈣激活鉀通道(large conductance Ca2+-activeted K+ channels，BKCa)的活性改變對平滑肌細胞衰老和衰老相關基因p16、p21表達的影響，以探討B(tài)KCa活性改變在動脈血管老化發(fā)病學中的意義，并進一步闡述動脈老化發(fā)生的分子機制。 方法：(1)二級清潔雄性SD大鼠，青年組和老年組各12只，采用

2、酶消化法對動脈平滑肌進行細胞培養(yǎng)，免疫細胞化學鑒定平滑肌細胞α-action。選取第2代平滑肌細胞進行實驗，每只大鼠均設立BKCa激活劑(NS1619)組、BKCa阻斷劑(Iberiotoxin，IBTX)組和對照組(未被干擾組)。(2)用β-半乳糖苷酶染色法對上述VSMC進行衰老細胞染色，初步觀察不同年齡組BKCa的活性改變對血管平滑肌細胞衰老的影響。(3)用RT-PCR方法對上述VSMC的p16和p21基因表達水平進行半定量分析，觀

3、察不同年齡動脈平滑肌細胞BKCa活性改變與衰老相關基因p16、p21關系。 結果：(1)倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的平滑肌細胞形態(tài)為長梭形，呈現(xiàn)平滑肌細胞典型的“峰"、“谷”樣生長。免疫細胞化學鑒定細胞純度為98％。(2)β半乳糖苷酶染色電鏡下觀察，不論青年組或是老年組，加入BKCa激活劑后衰老的平滑肌細胞數(shù)量較對照組顯著減少，加入BKCa阻斷劑后衰老細胞數(shù)量較對照組顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；BKCa激活劑組、對照組和

4、BKCa阻斷劑組衰老平滑肌細胞數(shù)量在老年組均較青年組多，衰老細胞染色陽性率在青年組和老年組之間差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；年齡和BKCa活性的改變對細胞衰老的影響存在著交互作用(P＜0.01)，BKCa的活性改變對老年組的影響更加明顯。(3)PCR結果顯示，無論是青年大鼠還是老年大鼠的動脈平滑肌細胞，在加入BKCa激活劑后p16表達水平較對照組明顯減少，加入BKCa阻斷劑后p16表達水平較對照組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(

5、P＜0.05)；BKCa激活劑組、BKCa阻斷劑組和對照組培養(yǎng)的VSMC細胞在青年組和老年組均可檢測到p21的表達，且老年組平滑肌細胞p21表達水平明顯高于青年組(P＜0.05)，而BKCa活性改變對p21表達無影響，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 結論：(1)NS1619可以抑制平滑肌細胞衰老，IBTX則促進平滑肌細胞衰老，這說明隨著血管的老化，BKCa的基因表達減少，活性降低，這反過來又引起平滑肌細胞衰老程度的增加。(2

6、)NS1619可以顯著抑制大鼠動脈VSMC p16基因的表達，IBTX則顯著增加VSMC p16基因的表達，而BKCa的活性改變對VSMC p21表達無影響，這種BKCa的活性改變對VSMC p16基因表達的影響可能是血管老化的分子機制之一。BKCa可能是通過p16INK4a/Rb/MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑影響著血管的老化。(3)無論BKCa活性改變與否，老年組衰老細胞染色陽性率大于青年組，其p16和p21基因表達也較青年組明顯，提示增齡本