腫瘤壞死因子凋亡相關(guān)配體（TRAIL）對(duì)乙肝病毒復(fù)制過程影響的初探.pdf

1、目的:腫瘤壞死因子凋亡相關(guān)配體(TNF-related apoptosis inducingligand，TRAIL)是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族的一員，在正常人體組織中廣泛存在，主要參與機(jī)體的免疫自穩(wěn)定、免疫監(jiān)控和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)，但對(duì)正常組織細(xì)胞基本無毒副作用，而主要選擇性作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)其凋亡。 鑒于有學(xué)者報(bào)道，TRAIL表達(dá)的降低可能與HBV感染的慢性化有關(guān)，我們推測(cè)，TRAIL可能在抑制乙肝病毒復(fù)制方面發(fā)揮某種作用。

2、為此，作者采用肝癌細(xì)胞株HepG2及其同種系的HepG2.215建立體外細(xì)胞模型，就TRAIL分子對(duì)HBV復(fù)制與轉(zhuǎn)錄的影響及其與凋亡的關(guān)系作了初步探索，希望可以為抗乙肝病毒治療找到新思路。 方法: 1．研究sTRAIL對(duì)HBV DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和表達(dá)的影響。將具有相同遺傳背景的肝癌細(xì)胞株HepG2．215和HepG2細(xì)胞作為體外模型，使2.5～20ng/ml sTRAIL分別作用于已與HBV基因組整合的HepG2.215

3、和轉(zhuǎn)染了乙肝病毒pHBV4.1的HepG2細(xì)胞，通過ELISA測(cè)定HepG2.215細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg量的變化情況(加sTRAIL 0～5天)；通過免疫組化觀察HepG2細(xì)胞分泌HBsAg、HbcAg的變化情況(加sTRAIL 48h后)；用Southern核酸吸印雜交檢測(cè)HepG2.215和HeDG2細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體水平，Northern核酸吸印雜交檢測(cè)HepG2細(xì)胞中3.5kb、2.4kb、2.1kb和0.7

4、kb HBV mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(加sTRAIL 48h后)。 2．用乙肝病毒全基因重組質(zhì)粒pHBV4.1轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，加入sTRAIL(10、20、100、200、1000ng/ml)作用48h后，以電泳觀察DNALadder形成實(shí)驗(yàn)，了解不同濃度的sTRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況。 結(jié)果: 1．Southern核酸吸印雜交的結(jié)果顯示，與未加sTRAIL的對(duì)照組相比，10ng/ml sTRAIL作用48h后

5、的實(shí)驗(yàn)組(已與HBV基因組整合的HepG2.215或轉(zhuǎn)染了乙肝病毒pHBV4.1的HepG2細(xì)胞)中的HBV復(fù)制中間體rcDNA、ssDNA均下降了3～20倍；Northern核酸吸印雜交的結(jié)果顯示，與未加sTRAIL的對(duì)照組相比，加了10ng/ml sTRAIL作用48h后的實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染了乙肝病毒pHBV4.1的HepG2細(xì)胞)中的HBV前基因組RNA(即3.5kb RNA)的轉(zhuǎn)錄水平下降了5～20倍。 2．ELISA檢測(cè)結(jié)果

6、顯示。加入不同濃度(0、2.5、5、10、20ng/ml)sTRAIL作用于HepG2.215細(xì)胞后，對(duì)其分泌HBsAg、HBeAg量進(jìn)行連續(xù)5天的觀察，各濃度組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差分析和兩兩比較后提示：與不加sTRAIL組相比，在2.5、5、10、20ng/ml范圍內(nèi)，加入sTRAIL后，第1天起HBsAg分泌量即均顯示減少(p<0.01)；且隨加入sTRAIL劑量的增加，HBsAg分泌量的減少更趨明顯(p<0.05)，顯示出藥效/濃度依

7、賴性。另一方面，與不加sTRAIL組相比，在2.5、5、10、20ng/ml范圍內(nèi)，加入sTRAIL后，從第3天起，5、10、20ng/ml組的HBeAg分泌量均顯示減少(P<0.05)；但sTRAIL各劑量組之間兩兩比較，HBeAg的分泌量沒有顯著性差異(p>0.05)。 3．免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示。10ng/ml sTRAIL作用于HepG2細(xì)胞48小時(shí)后，免疫組化檢測(cè)觀察到細(xì)胞中HBsAg、HbcAg分泌量表達(dá)明顯減少。

8、 4．LADDER實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，sTRAIL誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞(已轉(zhuǎn)染乙肝病毒pHBV4.1)凋亡的現(xiàn)象呈濃度依賴性。加入sTRAIL 100ng/ml組作用48小時(shí)后，則可見LADDER條帶，表明HepG2細(xì)胞已出現(xiàn)可檢測(cè)的凋亡；加入sTRAIL 200ng/ml組作用48小時(shí)后，LADDER條帶明顯變強(qiáng)。但是，在上述可以產(chǎn)生HBV復(fù)制及表達(dá)抑制現(xiàn)象的sTRAIL濃度10、20ng/ml組作用48小時(shí)后，HepG2細(xì)胞未見明顯凋亡

9、。 結(jié)論: 10ng/ml sTRAIL作用48小時(shí)后可使轉(zhuǎn)染了pHBV4.1的HepG2細(xì)胞分泌HBsAg、HBcAg量減少，HBV復(fù)制中間體DNA和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.5kb mRNA水平降低；HepG2.215細(xì)胞HBV復(fù)制中間體DNA生成減少。而2.5～20ng/ml濃度范圍內(nèi)sTRAIL作用48小時(shí)后，HepG2/215細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg量下降；且HBsAg下降趨勢(shì)呈sTRAIL濃度依賴性。另由LADDER