腺病毒介導(dǎo)CREG基因轉(zhuǎn)染在兔頸動脈損傷后新生內(nèi)膜形成中的作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)術(shù)后再狹窄(RS)與PCI發(fā)展相伴相隨，是當(dāng)今心血管病界的重要課題。大量研究表明，血管平滑肌細(xì)胞通過一系列分子機(jī)制發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，丟失其分化標(biāo)志物，并獲得增殖、遷移的能力，是新生內(nèi)膜形成及RS發(fā)生的病理基礎(chǔ)。近年來，大量抗增殖藥物，如雷帕霉素、紫杉醇等，廣泛用于臨床再狹窄的預(yù)防，在一定程度上降低了RS的發(fā)生。但是，這類藥物都不可避免地抑制了內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，從而引發(fā)了很多新的問題，如

2、遲發(fā)性血栓形成，延遲內(nèi)皮化等。因此，有必要尋找新的藥物以選擇性地抑制平滑肌細(xì)胞增殖，而不影響內(nèi)皮化。
　　E1A激活基因阻遏子(CREG)是新近發(fā)現(xiàn)的一個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因，它由220個氨基酸殘基構(gòu)成，有3個糖基化位點(diǎn)。CRERG在單核細(xì)胞、造血祖細(xì)胞和VSMC等多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞成熟分化，抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，在體外培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞從合成表型向收縮表型轉(zhuǎn)化的過程中，CREG表達(dá)上調(diào)，而CREG過表達(dá)也可以促

3、進(jìn)平滑肌細(xì)胞從合成表型向收縮表型轉(zhuǎn)化，因此，CREG有可能成為抑制PCI術(shù)后再狹窄的有效藥物。本研究以兔頸動脈球囊損傷模型為研究對象，應(yīng)用腺病毒載體介導(dǎo)CREG基因在損傷血管中大量表達(dá)并觀察CREG表達(dá)對VSMC表型轉(zhuǎn)換的調(diào)控及對損傷血管內(nèi)膜增生的影響，以期深入探討CREG基因在PCI術(shù)后再狹窄發(fā)生中的作用。
　　材料和方法：
　　以KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)將CREGcDNA全長亞克隆至pShuttle-CMV穿梭質(zhì)粒中，

4、以菌內(nèi)同源重組的方法構(gòu)建腺病毒重組子，在293細(xì)胞中包裝產(chǎn)生CREG重組腺病毒。以CREG重組腺病毒及GFP對照腺病毒感染人VSMC細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光染色、Westernblot方法檢測CREG和平滑肌分化標(biāo)志蛋白SMα-actin、SMMHC表達(dá)，檢測細(xì)胞增殖指標(biāo)BrdU陽性細(xì)胞比例，以探討CREG對VSMC分化的影響。應(yīng)用雄性日本大耳白兔60只，建立頸動脈球囊拉傷模型，隨機(jī)分為3組，分別將含有Ad-CREG、Ad-GFP的病毒液或P

5、BS1ml，注入損傷動脈段內(nèi)孵育30min。各組動物于術(shù)后3d、7d、14d和28d行雙側(cè)頸總動脈造影，觀察靶血管血流情況。術(shù)后經(jīng)靜脈注射50mg溴脫氧尿嘧啶，3小時后處死，取出損傷動脈及對側(cè)未損傷的動脈。HE染色觀察不同時間點(diǎn)血管SMC的移行、增殖及內(nèi)膜、中膜增厚情況。免疫組化及Westernblot分析CREG及平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物SMα-actin、SMMHC的表達(dá)。
　　研究結(jié)果：
　　成功構(gòu)建重組腺病毒載體Ad-CRE

6、G；體外研究發(fā)現(xiàn)，腺病毒能夠高效感染人VSMC細(xì)胞，使外源性基因在被目的細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)。CREG轉(zhuǎn)染能促進(jìn)VSMC分化，抑制VSMC增殖。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，在兔頸動脈球囊損傷修復(fù)過程中CREG表達(dá)與平滑肌細(xì)胞分化狀態(tài)相關(guān)，免疫組織化學(xué)和Westernblot結(jié)果顯示，CREG在正常VSMC中高度表達(dá)，在球囊損傷后3d，血管中CREG顯著下降，到第7d表達(dá)開始恢復(fù)，在此后的14d，28d一直保持高表達(dá)狀態(tài)。VSMC分化標(biāo)記物SMα-actin

7、和MHC在球囊損傷兔頸動脈中的表達(dá)趨勢與CREG相似，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示SMα-actin和MHC在正常的VSMC中高度表達(dá)，而在球囊損傷后3d和7d表達(dá)顯著降低，球囊損傷后14d后表達(dá)逐漸恢復(fù)到正常水平。而細(xì)胞增殖指標(biāo)BrdU染色則表現(xiàn)出相反的趨勢，在正常動脈中BrdU陽性細(xì)胞很少，在損傷后3d和7dBrdU陽性細(xì)胞大量出現(xiàn)，至14d再次降低到接近未損傷水平。
　　形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，兔頸動脈球囊損傷后有明顯的新生內(nèi)膜形成，A

8、d-CREG轉(zhuǎn)染顯著減少新生內(nèi)膜形成，與對照組和Ad-GFP組相比，Ad-CREG組的內(nèi)膜面積在動脈球囊損傷后28d降低了約50％，而I/M分別也降低了50％以上。雙側(cè)頸動脈造影顯示，Ad-CREG組術(shù)后28d的最小管腔內(nèi)徑明顯高于鹽水對照組和Ad-GFP組，而管腔狹窄率低于鹽水對照組和Ad-GFP組。以上數(shù)據(jù)都說明，CREG轉(zhuǎn)染可明顯抑制頸動脈損傷后的新生內(nèi)膜增生，防止再狹窄發(fā)生。
　　免疫組織化學(xué)染色顯示，對照組和Ad-GFP

9、組在損傷后3d和7d可見大量BrdU陽性細(xì)胞，而Ad-CREG組BrdU陽性細(xì)胞明顯減少。與BrdU染色結(jié)果相反，在血管損傷后7d，Ad-CREG治療組血管SMα-actin，MHC表達(dá)水平顯著高于生理鹽水對照組和Ad-GFP組。這些結(jié)果表明，在動脈損傷修復(fù)的過程中，CREG能夠促使平滑肌細(xì)胞保持在穩(wěn)定的分化狀態(tài)。
　　免疫組織化學(xué)CD31染色表明，球囊損傷后14d，損傷動脈新生內(nèi)膜表面內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋不完全，Ad-CREG組與對照組