重組腺病毒介導(dǎo)的人類eNOS基因轉(zhuǎn)染治療大鼠慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓.pdf

1、本研究通過(guò)建立慢性缺氧性肺動(dòng)脈高壓(Chronichypoxic pulmonary hypertension，CHPH)模型，并經(jīng)呼吸道途徑將AdCMVceNOS轉(zhuǎn)染人大鼠體內(nèi)。旨在探討重組eNOS轉(zhuǎn)基因治療PAH的可行性、效果及其可能機(jī)制，為基因治療PAH的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Wistar大鼠150只，體重220～280g，由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 實(shí)驗(yàn)主要儀器： 小型動(dòng)物呼吸機(jī)(Ha

2、rvard 638型，美國(guó))；多功能監(jiān)測(cè)儀(Darex Ohmeda S/5，芬蘭)；壓力換能器(Edwards LifeSciences，美國(guó))；低溫高速離心機(jī)(Sorvall ST-70，美國(guó))；臺(tái)式離心機(jī)(Sigma，美國(guó))；JUNG-CM1800型切片機(jī)(上海)；超聲粉碎機(jī)及水平電泳儀(Biorad，美國(guó))；水浴式電轉(zhuǎn)印槽(DYY-Ⅲ40B型，北京六一儀器廠)；生化培養(yǎng)箱(LRH-150B，廣州醫(yī)療器械廠)；K一-D電熱恒溫水浴

3、槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Olympus光學(xué)顯微鏡(日本)；微量加樣器(德國(guó)GILSON公司)；分析天平(上海天平儀器廠)；PTC-100型PCR儀(美國(guó))；紫外分光光度計(jì)(德國(guó)EPPENDORF公司)；N02120MAX21g電子天平(NAVIGATOR公司)；PE 7000全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國(guó)Perkin Elmer公司)；凝膠自動(dòng)分析成像系統(tǒng)(Cham image 5500，美國(guó))。 實(shí)驗(yàn)試劑： 小鼠

4、抗人eNOS單克隆抗體(BD公司)；ECL試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司)；重組腺病毒載體AdCMVceNOS質(zhì)粒DNA(由Dr Robert Gerard惠贈(zèng))； pXC<,1>載體(加拿大Mierobix Biosystems公司)；腺病毒E<,1>區(qū)轉(zhuǎn)化人胚胎腎細(xì)胞株293(加拿大Microbix Biosystems公司)；瓊脂糖、溴化乙錠(GENE公司)；一氧化氮試劑盒(南京建成生物公司)；Trizol(Invitrogen公司

5、)；RT PCR．試劑盒(德國(guó)QLAGEN公司)；定量PCR buffer(美國(guó)ABI公司)；dNTPs(Sigma公司)；熒光探針(上海生工)；Taq酶(美國(guó)ABI公司)。 實(shí)驗(yàn)方法： 1.eNOS/NO體系在CHPH大鼠中的變化：選用雄性Wistar大鼠50只，隨機(jī)分為5組：常氧組(N組)，低氧7天組(H7d)，低氧14天組(H14d)，低氧21天組(H21d)，低氧28天組(H28d)，每組10只。低氧組大鼠置于常

6、壓低氧箱內(nèi)，將氮氧混合氣(90％N<,2>和10％O<,2>的混合氣)通人低氧箱，箱內(nèi)放置變色硅膠和無(wú)水氯化鈣吸收二氧化碳和水份。在麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)下，使氧濃度平衡在(10.0±0.5)％，CO<,2>濃度為(3.0±0.5)％。每天置人8 h，依其分組，分別在常壓低氧箱內(nèi)飼養(yǎng)7、14、21和28天。常氧組除吸空氣外，飼養(yǎng)條件同低氧各組。測(cè)定各組頸外動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈血NO含量、eNOS蛋白表達(dá)，并用彈力纖維染色觀察肺血管構(gòu)型的

7、改變。 2．重組腺病毒介導(dǎo)的eNOS基因在大鼠肺內(nèi)的轉(zhuǎn)染：雄性Wistar大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組(N組)和重組eNOS基因轉(zhuǎn)染組(T組)。T組通過(guò)呼吸道將總量為3×10<'9>pfu重組eNOS基因轉(zhuǎn)導(dǎo)人大鼠肺內(nèi)，N組只導(dǎo)入等容量病毒稀釋液。T組又分為轉(zhuǎn)染后第2、5、7、14、21五個(gè)亞組，即T2d組，T5d組，T7d組，T14d組，T21d組。每組10只。觀測(cè)各組外源性轉(zhuǎn)染的eNOS基因表達(dá)情況以及肺動(dòng)脈血NO含量。

8、 3.eNOS基因轉(zhuǎn)染治療CHPH：雄性Wistar大鼠40只，慢性缺氧3周后，隨機(jī)分為缺氧組(H組)和重組eNOS基因轉(zhuǎn)染組(T組)，T組通過(guò)呼吸道轉(zhuǎn)人AdCMVceNOS，H組只導(dǎo)人等容量病毒稀釋液。T組又分為三個(gè)亞組，低劑量組(TL組)、中劑量組(TM組)和高劑量組(TH組)，接受病毒載體總量分別為1×10<'9>pfu、3×10<'9>pfu和5×10<'9>pfu。觀測(cè)各組頸外動(dòng)脈壓、肺動(dòng)脈壓變化，并檢測(cè)肺動(dòng)脈血NO含量，觀

9、測(cè)外源性轉(zhuǎn)染的eNOS基因在肺內(nèi)的表達(dá)情況以及肺血管構(gòu)型的改變。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.各組平均頸外動(dòng)脈壓(mCAP)相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。 2.與常氧組(N組)相比：H14d組、H21d組和H28d組平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)明顯增加(P<0.05)，尤以H21d組mPAP最高，與H14d組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；H21d組和H28d組eNOS蛋白表達(dá)A值明顯增加(P<0.05)；肺動(dòng)脈血中NO含

10、量明顯降低(P<0.05)；H21d和H28d組無(wú)肌型動(dòng)脈(None muscle artery，NMA)百分比較N組、H7d組和H14d組明顯減少，環(huán)肌型動(dòng)脈(Circular muscle artery，CMA)百分比明顯增加(P<0.05)。 3.與未轉(zhuǎn)染AdCMVceNOS組(N組)相比：T2d組、T5d組、T7d組、T14d組和T21d組肺組織中eNOS蛋白含量，總RNA含量，肺動(dòng)脈血中NO含量明顯增加(P<0.05)

11、。T7d組與T2d組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 4.與單純?nèi)毖鹾?W未轉(zhuǎn)入AdCMVceNOS組(H組)相比：TM組和TH組mPAP明顯降低(P<0.05)；肺組織中eNOS蛋白含量、總RNA含量、肺動(dòng)脈血中NO含量明顯增加(P<0.05)。TM組和TH組NMA較H組明顯增加，CMA明顯減少(P<0.05)。 5.T7d組肝、脾、腎無(wú)eNOS陽(yáng)性表達(dá)。 6.TH組肺組織有炎性浸潤(rùn)表現(xiàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

12、 1.由eNOS質(zhì)的缺陷引起的eNOS/NO體系功能障礙，是CHPH形成的主要原因。 2.經(jīng)氣道途徑，通過(guò)重組腺病毒介導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)了外源eNOS基因在肺臟的充分表達(dá)。 3.基因表達(dá)起效時(shí)間快(2天)，于7天達(dá)高峰，并可持續(xù)21d或以上。 4.基因表達(dá)的靶向性高，無(wú)遠(yuǎn)隔器官表達(dá)。 5.基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定，具備正常的酶學(xué)活性。 6.在一定劑量范圍內(nèi)，基因表達(dá)效率與腺病毒載體劑量呈正相關(guān)。以載體劑量為