幾丁糖介導(dǎo)eNOS基因轉(zhuǎn)移預(yù)防兔頸動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄的初步研究.pdf

1、該研究中，首先擴(kuò)增了攜帶目的基因的質(zhì)粒pCDNA3-eNOS，經(jīng)酶切鑒定和線性化處理，成功地與穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV構(gòu)建了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pAdTrack-eNOS.再通過細(xì)菌內(nèi)同源重組構(gòu)建了病毒骨架質(zhì)粒pAd-CMV-eNOS-CMV-GFP.病毒骨架質(zhì)粒再經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝，成為具有感染力的腺病毒載體Ad-eNOS.我們用構(gòu)建的pAdTrack-CMV-eNOS和幾丁糖反應(yīng)制備幾丁糖/質(zhì)粒復(fù)合體，同時(shí)構(gòu)建的攜帶相同目的基因的腺

2、病毒載體，旨在和CPC進(jìn)行比較研究.結(jié)果表明所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pAdTrack-CMV-eNOS和Ad-eNOS經(jīng)酶切鑒定正確連接，同時(shí)能夠轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，成功表達(dá)了eNOS蛋白.構(gòu)建Ad-eNOS耗時(shí)達(dá)三個(gè)多月，耗資大.我們使用分子量70kDa的幾丁糖，通過提純，消毒，制成幾丁糖的醋酸溶液.根據(jù)幾丁糖分子上的氨基（N）數(shù)目和質(zhì)粒DNA分子上磷酸基（P）的數(shù)目的比值（N/P），和攜帶編碼內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endothelial

3、nitric oxide synthase,eNOS）基因的質(zhì)粒chitosan/pAdTrack-CMV-eNOS，通過靜電反應(yīng)形成復(fù)合體制備了不同N/P比值的幾丁糖/質(zhì)粒復(fù)合體（chitosan/pAdTrack-CMV-eNOS complexes,CPC-eNOS）.通過瓊脂糖凝膠電泳和透射電鏡證實(shí)了CPC-eNOS的形成.該研究分離培養(yǎng)了SD大鼠原代胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，通過熒光顯微鏡直接觀察，F(xiàn)CM檢測以及Western

4、Blot技術(shù)，初步研究了CPC-eNOS介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和影響轉(zhuǎn)染效率的可能因素如pH值，N/P比值和血清濃度.我們的研究結(jié)果表明，幾丁糖能和質(zhì)粒形成CPC-eNOS，合成過程簡單方便，成本低廉.由于幾丁糖分子上的氨基是化學(xué)性質(zhì)活潑的基團(tuán)，具有很強(qiáng)的質(zhì)子化能力.而質(zhì)粒DNA分子帶有負(fù)電荷的磷酸基，兩者通過靜電反應(yīng)形成CPC-eNOS.基于CPC-eNOS形成的原理，這一過程無疑會(huì)受到介質(zhì)pH值的影響.不同N/P

5、比值的CPC-eNOS表面具有不同性質(zhì)和量的電荷，血管平滑肌細(xì)胞表面帶有負(fù)電荷.轉(zhuǎn)染過程的第一步就是載體和細(xì)胞的接近和粘附，然后通過入胞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi).因此pH值不僅影響CPC表面的電化學(xué)特性，也直接影響到轉(zhuǎn)染效果.作為陽離子聚合物，幾丁糖和質(zhì)粒DNA形成聚電解質(zhì)，從而保護(hù)DNA免于被核酶降解，這保證了足夠量的DNA能夠有機(jī)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞.過度誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能對球囊損傷內(nèi)膜的愈合產(chǎn)生影響，而CPC-eNOS的表達(dá)效能和Ad-eNOS比較較弱

6、，加之幾丁糖具有促進(jìn)傷口愈合的作用，因此CPC-eNOS介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移時(shí)具有合理性和較高安全性.轉(zhuǎn)染介質(zhì)中的血清濃度能夠提高血管平滑肌細(xì)胞活力，提高轉(zhuǎn)染效率.結(jié)果還表明，用預(yù)先配制好的幾丁糖溶液和質(zhì)粒溶液，合成CPC-eNOS非常方便，轉(zhuǎn)染時(shí)新鮮配制并不復(fù)雜.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明CPC-eNOS成功介導(dǎo)了血管壁的基因轉(zhuǎn)移，和裸質(zhì)粒組及空白對照組比較，能有效地抑制血管損傷后再狹窄程度，但抑制程度不如Ad-eNOS顯著.考慮到幾丁糖的良好生物相容性、