人臍帶間充質(zhì)干細胞復合nHA-PA66支架材料的骨組織工程實驗研究.pdf

1、因外傷、感染、腫瘤等因素造成骨缺損是骨科臨床常見疾病。較小范圍的骨缺損可以由機體自身的再生得到修復,大范圍骨缺損由于成骨細胞難以越過而不能正常愈合,若不采用適當治療則最終僅由纖維組織充填,形成骨不連。而大范圍骨缺損的修復目前仍是臨床上難以完全解決的問題。目前常用的有自體骨移植、異體/異種骨移植、人工合成骨替代品等方法修復骨缺損,都有其優(yōu)缺點。骨組織工程學是利用組織工程原理對骨缺損進行修復和重建的一門學科,近年來,將種子細胞與特定支架材料

2、復合,在體外構(gòu)建具有生命的活性組織工程化復合材料是骨組織工程學研究的熱點。本實驗根據(jù)骨組織工程學基本原理,培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞,成骨誘導后復合納米羥基磷灰石/聚酰胺66支架材料,植入裸鼠體內(nèi)觀察其成骨的情況,為進一步建立骨組織工程的動物模型及滿足治療骨缺損的臨床需要提供理論基礎。
　　 第一章臍帶間充質(zhì)干細胞的提取、分離、純化增殖及生物學特性
　　 目的：研究探討人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、增殖方法,并研究其生物學

3、特性,以期將其作為骨組織工程種子細胞。
　　 方法：取足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒的臍帶,D-Hank's液充分洗滌,將臍帶剪碎至1mm3大小組織塊,運用膠原酶消化法從人臍帶中分離獲取間充質(zhì)干細胞。加入含胎牛血清體積分數(shù)為0.1的DMEM/F12培養(yǎng)基中進行原代培養(yǎng)；待細胞生長至80-90％融合時,1：3傳代培養(yǎng),倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。MTT法測定第3、5、7代細胞生長曲線。流式細胞學檢測第3代細胞的表面抗原分子。
　　 結(jié)

4、果：原代培養(yǎng)后24小時可見少量散在貼壁細胞,2-3天后可見梭形和多角形貼壁細胞；5-6天后可見梭形類貼壁細胞明顯增多,增長速度增快,10-12天左右細胞融合接近80-90％。傳2代以后細胞形態(tài)均一,呈長梭形,接近融合狀態(tài)時可呈漩渦樣生長。流式細胞儀檢測第3代細胞有97％表達CD105,95％表達CD29,96％表達CD44,97％表達CD13,而只有0.8％表達CD45,1.8％表達CD31,1.2％表達HLA-DR。生長曲線顯示傳3、

5、5、7代臍帶間充質(zhì)干細胞均有較強的增殖能力。
　　 結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細胞分離提取操作簡便易行,且具有一般間充質(zhì)干細胞生物學特性,可作為骨組織工程的種子細胞。
　　 第二章人臍帶間充質(zhì)干細胞的體外成骨誘導分化
　　 目的：探討人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)體外誘導向成骨細胞定向分化的條件及能力,為進一步體內(nèi)成骨研究奠定基礎。
　　 方法：(1)如第一章方法,分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細胞。(2)以含10％FBS、地塞

6、米松、抗壞血酸、維生素C、β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM作為成骨誘導培養(yǎng)基,誘導第3代臍帶間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。倒置顯微鏡、HE染色觀察細胞形態(tài)變化。進行堿性磷酸酶染色及活性定量檢測,茜素紅S標記鈣結(jié)節(jié)形成情況。(3)RT-PCR檢測骨橋蛋白、骨鈣素、堿性磷酸酶的mRNA的表達。(4)免疫細胞化學染色及Western blotting檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達。
　　 結(jié)果：(1)人臍帶間充質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導后,細胞體積增大,呈

7、短梭形、多角形；細胞呈集落樣層疊生長。(2)成骨誘導14天,堿性磷酸酶染色呈陽性表達；成骨誘導14天內(nèi),可見堿性磷酸酶含量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增高。茜素紅S染色呈紅色。(3)誘導后7天、14天后RT-PCR鑒定骨橋蛋白、骨鈣素、堿性磷酸酶mRNA的表達,在151bp、155bp及182bp有單一的目的條帶,誘導后14天的細胞骨橋蛋白、骨鈣素、堿性磷酸酶mRNA的表達水平均強于誘導后7天的細胞。(4)成骨誘導7天,Ⅰ型膠原蛋白免疫組化染

8、色及Western blotting檢測可見陽性表達,誘導組Ⅰ型膠原蛋白表達強度明顯高于對照組(P0.05)。
　　 結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細胞在體外成骨誘導培養(yǎng)下可定向成骨分化,并能夠穩(wěn)定表達成骨細胞特異性表型,具有成骨能力。
　　 第三章：人臍帶間充質(zhì)干細胞與nHA/PA66復合支架生物相容性的體外實驗研究
　　 目的：研究人臍帶間充質(zhì)干細胞與nHA/PA66復合支架的生物相容性，探討nHA/PA66復合支架作

9、為人臍帶間充質(zhì)干細胞載體的可能性，為骨組織工程進一步實驗提供理論依據(jù)。
　　 方法：(1)如前述方法制備人臍帶間充質(zhì)干細胞。(2)取成骨誘導后的第3代人臍帶間充質(zhì)干細胞接種于備好的nHA/PA66支架材料上，觀察hUCMSCs在nHA/PA66支架材料的生長情況，MTT法測定nHA/PA66對成骨誘導后第3代hUCMSCs生長增殖的影響。(3)檢測堿性磷酸酶染色、活性定量檢測及I型膠原蛋白的表達。(4)檢測成骨誘導后第3代hUC

10、MSCs在nHA/PA66支架上的細胞粘附率，分別于2、4、8天取樣并計算材料細胞毒性。(5)RT-PCR檢測第3代hUCMSCs接種nHA/PA66支架7天OPN、OCN、ALP的mRNA的表達。(6)取材行掃描電鏡觀察細胞在材料的生長增殖情況。
　　 結(jié)果：(1)成骨誘導后的第3代hUCMSCs在nHA/PA66支架材料上生長分化良好。MTT法測定OD值證實，hUCMSCs生長增殖活性不受材料影響，與對照組相比，差異無統(tǒng)計學

11、意義(P>0.05)。(2)hUCMSCs復合nHA/PA66多孔材料培養(yǎng)，ALP和I型膠原免疫組化染色為陽性，成骨誘導14天內(nèi)，可見堿性磷酸酶含量隨著培養(yǎng)時間延長而逐漸增高。(3)細胞4h、8h、12h、24h粘附率分別為69.1±2％、78.4±2％、82％±2％及91％±2％。(4)第2天、第4天時間點支架材料細胞毒性評級均為0級，第8天毒性評級為1級，均評價為無毒。(5)在細胞復合支架后7天，RT-PCR鑒定骨橋蛋白、骨鈣素、堿

12、性磷酸酶mRNA的表達結(jié)果顯示，實驗組在151bp、155bp及182bp有單一的目的條帶，其表達強度明顯高于對照組(P<0.05)。(6)1天后掃描電鏡觀察，可見細胞在支架材料表面附著生長；7天后可見細胞在材料上生長良好，細胞可往空隙生長，材料空隙大量充填。
　　 結(jié)論：納米羥基磷灰石/聚酰胺66多孔支架材料可作為骨組織工程中人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞載體，無毒，生物相容性良好，不影響該細胞的生長增殖及成骨分化，滿足骨組織工程的

13、需要。
　　 第四章：人臍帶間充質(zhì)干細胞復合nHA/PA66支架異位成骨作用的實驗研究
　　 目的：探討了成骨誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞復合nHA/PA66支架材料在裸鼠體內(nèi)異位成骨的情況，為進一步骨缺損動物實驗提供理論依據(jù)。
　　 方法：(1)如第三章所述方法，將成骨誘導人臍帶間充質(zhì)干細胞接種nHA/PA66支架材料復合培養(yǎng)；(2)分別將成骨誘導后hUCMSCs懸液、單純nHA/PA66支架材料、成骨誘導hUCMS

14、Cs與nHA/PA66支架復合體植入裸鼠背部肌袋內(nèi)，觀察其異位體內(nèi)成骨情況。(3)術后4、8、12周取材行HE染色及骨鈣素蛋白免疫組織化學染色觀察表達情況。(4)掃描電鏡觀察其成骨能力。
　　 結(jié)果：成骨誘導后hUCMSCs組、單純nHA/PA66支架材料組在裸鼠背部肌袋中無骨質(zhì)形成，成骨誘導hUCMSCs與nHA/PA66支架復合體組有骨質(zhì)形成，同時材料部分降解。
　　 結(jié)論：成骨誘導的hUCMSCs與nHA/PA66