Mic和Amic的冠突偽尾柱蟲的差異表達(dá)基因的克隆和功能研究.pdf

1、纖毛蟲大核和小核的分化，正如高等動物有體細(xì)胞和生殖細(xì)胞分化一樣，二者在本質(zhì)上十分相似。近二十年來，本實驗室對多種腹毛類纖毛蟲有小核細(xì)胞(Micronucleates，Mic)和無小核細(xì)胞(Amicronucleates，Amic)的比較研究證明，它們的小核都具有明顯的體功能，盡管其表現(xiàn)形式不盡相同。這些研究結(jié)果無疑突破了傳統(tǒng)的大、小核分工理念，為小核的體功能積累了大量細(xì)胞學(xué)證據(jù)。那么，小核體功能的遺傳機理是什么?兩種細(xì)胞系不同生長、發(fā)育

2、階段的基因表達(dá)譜有何差異?相關(guān)差異表達(dá)基因的結(jié)構(gòu)與功能如何?帶著這些問題，在詳細(xì)綜述國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀和前人工作的基礎(chǔ)上，本論文從細(xì)胞學(xué)和分子遺傳學(xué)兩個方面分四部分展開了研究。 第一部分、對冠突偽尾柱蟲Mic細(xì)胞和Amic進行了細(xì)胞學(xué)研究。采用橫向切割方法建立多個Amic細(xì)胞系，通過蛋白銀染色技術(shù)和激光共聚焦技術(shù)驗證了Amic細(xì)胞AZM缺損的表型與獲得Amic細(xì)胞系的切割方法無關(guān)。同時，前人關(guān)于“AZM小膜結(jié)構(gòu)缺損產(chǎn)生于分裂間期，

3、但通過新一輪的形態(tài)發(fā)生，其AZM又能得到恢復(fù)”的結(jié)論被再次獲得證實。放線菌素D是基因轉(zhuǎn)錄的抑制劑，用其處理冠突偽尾柱蟲Amic間期細(xì)胞，能大大降低AZM的缺損率。據(jù)此推測，Amic細(xì)胞AZM結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性很可能與兩種細(xì)胞系間存在基因表達(dá)差異有關(guān)。 第二部分、對冠突偽尾柱蟲Mic細(xì)胞系和Amic細(xì)胞系在無性繁殖周期的三個應(yīng)激條件下的差異表達(dá)基因進行了克隆和鑒定。利用抑制性消減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建三個正向消減文庫和一個反向消減文庫

4、，對其中1030個克隆進行了篩選，對所得107個陽性克隆進行了序列分析，共獲得65個可能參與纖毛蟲細(xì)胞分化與發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期調(diào)控、脅迫應(yīng)答和細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的EST。同時，利用實時半定量熒光PCR對代表性陽性克隆在兩細(xì)胞系的表達(dá)差異進行了相對定量分析。結(jié)果表明：Mic細(xì)胞系和Amic細(xì)胞系在相同的應(yīng)激條件下呈現(xiàn)明顯的表達(dá)差異，序列分析的結(jié)果暗示：小核的失去可能導(dǎo)致細(xì)胞鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂，細(xì)胞脅迫響應(yīng)能力下降，為第一部分的細(xì)胞形態(tài)學(xué)

5、研究結(jié)果提供了分子遺傳機理方面的佐證。 第三部分、在前人細(xì)胞學(xué)觀察的基礎(chǔ)上，對冠突偽尾柱蟲Mic細(xì)胞系和Amic細(xì)胞系在接合生殖階段差異表達(dá)的基因進行了克隆和鑒定。利用SSH技術(shù)構(gòu)建了一個正向消減文庫，對其中80個克隆進行了篩選，對32個陽性克隆進行了序列分析，共鑒定出23個差異表達(dá)的EST，它們分別與RNA干涉、DNA復(fù)制與修復(fù)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)與調(diào)控以及脅迫應(yīng)答有關(guān)。同時，利用實時半定量熒光PCR對8個代表性陽性克隆在

6、Mic×Mic與Amic×Amic兩種交配組合的表達(dá)差異進行了相對定量分析。結(jié)果表明，Mic×Mic與Amic×Amic兩種交配組合在第一次皮膜改組之前存在明顯的基因表達(dá)差異。據(jù)此本文提出假設(shè)，認(rèn)為Amic×Amic第一次形態(tài)發(fā)生事件出現(xiàn)異常與失去小核進而引發(fā)一系列基因表達(dá)負(fù)調(diào)控因子的喪失有關(guān)。 第四部分、利用RACE技術(shù)和Mac-end-Mac技術(shù)對兩種細(xì)胞系有性和無性生活周期中代表性差異表達(dá)基因的全長進行了克隆和功能分析。

7、 1.克隆了在無性生活周期存在明顯表達(dá)差異的Y180的全長大核基因和cDNA。生物信息學(xué)分析提示，這一新基因可能在細(xì)胞生長、胞外分泌及細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要功能。利用RNAi喂飼技術(shù)對該基因的功能進行初步鑒定表明，其mRNA表達(dá)受到抑制后，細(xì)胞皮層結(jié)構(gòu)發(fā)生錯誤排列，大核在整個細(xì)胞質(zhì)的空間位置，數(shù)目和形態(tài)發(fā)生明顯變化。 2.克隆了HSP70和HSP90全長大核基因以及HSP90全長cDNA序列。生物學(xué)信息學(xué)分析表明，所克隆

8、的HSP90定位于細(xì)胞質(zhì)，HSP70定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。間接免疫熒光技術(shù)觀察表明，HSP70參與了冠突偽尾柱蟲纖毛器和其它微管胞器的構(gòu)成。通過高溫誘導(dǎo)HSP70和HSP90表達(dá)，Amic細(xì)胞培養(yǎng)群體中口器缺損率明顯下降。結(jié)合前人的相關(guān)研究結(jié)果，本文提出假設(shè)認(rèn)為，HSP70可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和微管修復(fù)機制參與Amic細(xì)胞缺損口器的修復(fù)。 3.克隆了Mic細(xì)胞系有性生活周期上調(diào)表達(dá)幅度最大的PPD的全長大核基因，并利用RNAi喂飼技術(shù)驗證