Sublytic C5b-9誘導(dǎo)Thy-1腎炎GMCs凋亡的機制研究.pdf

1、第一部分 Thy-1腎炎大鼠腎內(nèi)補體C5b-9復(fù)合物沉積與其凋亡病變的關(guān)系分析 目的：復(fù)制人類系膜增生性腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)動物模型，即大鼠Thy-1腎炎(Thy-1 nephritis，Thy-1 N)模型，觀察Thy-1 N大鼠腎小球內(nèi)補體C5b-9復(fù)合物的沉積情況及其不同階段的病理變化，探討C5b-9復(fù)合物在Thy-1 N大鼠腎小球內(nèi)的沉積

2、和Thy-1 N病變規(guī)律。同時，研究耗竭補體對Thy-1 N凋亡病變的影響，并在體外觀察用C5b-9復(fù)合物刺激培養(yǎng)的腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cells，GMCs)能否誘導(dǎo)細胞凋亡的情況。探討C5b-9復(fù)合物的沉積與凋亡病變之間的相關(guān)關(guān)系。 方法：(1)利用Thy-1抗體(Thy-1 antibody,Thy-1 Ab)復(fù)制大鼠Thy-1 N模型，并用眼鏡蛇毒因子(Cobra venom fact

3、or,CVF)耗竭補體。大鼠隨機被分為3組，即Thy-1 N組、CVF+Thy-1 N組和正常對照組。取各組大鼠腎皮質(zhì)，行光鏡、電鏡和TUNEL染色檢查判斷其腎小球細胞的病理變化。(2)在質(zhì)控亞溶解型C5b-9復(fù)合物(sublytic C5b-9)形成的基礎(chǔ)上，將體外培養(yǎng)的GMCs作不同的分組處理，經(jīng)Annexin V(AV)。propidium iodide(PI)雙染后，應(yīng)用流式細胞儀定量分析GMCs凋亡變化。 結(jié)果：(1)

4、免疫組化染色顯示，實驗40 min時，Thy-1 N大鼠腎小球內(nèi)即可見補體C5b-9復(fù)合物的沉積，主要分布于腎小球系膜區(qū)及GMCs表面，3 h時更為顯著。此時，被C5b-9沉積包繞的GMCs并未發(fā)生溶解壞死，但隨著病程的進展，有C5b-9沉積的GMCs逐漸減少，C5b-9染色強度亦逐漸減弱，7 d時C5b-9染色與對照組之間已無明顯差異。(2)Thy-1 N大鼠光鏡下可見24 h時腎小球細胞溶解壞死，數(shù)量下降；病程7 d，腎小球細胞數(shù)顯

5、著增多；電鏡下，實驗40 min時，GMCs呈現(xiàn)凋亡改變，24 h時GMCs已有溶解，7 d時GMCs明顯增生，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)也顯著積聚。TUNEL檢查證實，實驗40 min和3 h時，凋亡細胞陽性著色較多，亮度較強；隨著病程的進展，凋亡細胞明顯減少且熒光強度顯著下降。應(yīng)用CVF耗竭補體，能顯著減輕Thy-1 N早期的GMCs凋亡病變。(3)流式細胞儀定量分析顯示，體外培養(yǎng)的GMCs用su

6、blytic C5b-9復(fù)合物刺激亦能誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。 結(jié)論：(1)Thy-1 N早期大鼠GMCs表面有亞溶解型補體C5b-9復(fù)合物的沉積。(2)Thy-1 N大鼠腎組織病變確實存在凋亡、壞死和繼發(fā)增生三個時相，早期以凋亡病變?yōu)橹鳌?3)補體C5b-9復(fù)合物與大鼠Thy-1 N早期GMCs凋亡病變有一定的關(guān)系。 第二部分基因芯片篩查體內(nèi)和體外同期共表達凋亡相關(guān)基因 目的：(1)篩選Thy-1 N大鼠發(fā)病早期40

7、 min和3 h時腎組織和體外用亞溶解劑量的C5b-9復(fù)合物(sublytic C5b-9)刺激40 min和3 h時GMCs的基因譜變化，尋找體內(nèi)外同期共表達差異基因。(2)檢查凋亡相關(guān)基因--IRF-1(interferon regulatory factor 1)mRNA豐度和蛋白表達水平，從基因?qū)用嫔咸接慣hy-1 N大鼠GMCs凋亡的可能原因。 方法：采用大鼠。Thy-1 N模型作為體內(nèi)模型，sublytic C5b-

8、9刺激的GMCs作為體外模型，應(yīng)用基因芯片雜交技術(shù)篩選Thy-1 N大鼠發(fā)病40 min和3 h時腎組織和sublytic C5b-9刺激40 min和3 h時GMCs的基因譜變化，尋找體內(nèi)外同期共表達差異基因，并登陸Affymetrix公司網(wǎng)站和Genebank，在其提供的數(shù)據(jù)庫中進行分析，獲取相關(guān)功能信息。選擇體內(nèi)外同期共表達上調(diào)且可能與凋亡相關(guān)的IRF-1基因，應(yīng)用RT-PCR、real-time PCR、Western blot

9、ting和免疫組化技術(shù)分析其mRNA豐度和蛋白表達水平。 結(jié)果：(1)基因芯片顯示，在15923個基因中，Thy-1 N大鼠腎組織上調(diào)基因在40 min時為667個，3 h時為173個，其中部分是凋亡相關(guān)的基因和調(diào)控基因，部分為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因及一些組織增生相關(guān)基因；腎組織下調(diào)基因在建模40min時為14個，3 h時為33個，其中一些是酶類基因，部分為生長因子和細胞因子受體基因等。體外用sublytic C5b-9刺激誘導(dǎo)的G

10、MCs在40 min時上調(diào)基因為536個，3 h時為486個，包括凋亡相關(guān)的基因和調(diào)控基因、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因、增生相關(guān)基因等；下調(diào)基因在誘導(dǎo)40 min時為397個，3 h時為494個，其中部分為酶類和細胞因子及受體相關(guān)基因和一些未知基因等。(2)將Thy-1 N大鼠腎組織變化的基因譜系與sublytic C5b-9誘導(dǎo)的GMCs相關(guān)基因譜系進行同期比對，找出體內(nèi)和體外同期共表達上調(diào)基因10個，即：IRF-1，activatingtra

11、nscription factor 3(ATF3)，connective tissue growth factor(CTGF)，heme oxygenase 1(HO-1)，growth arrest and DNA-damage-inducible 45(Gadd 45)，dual specificity phosphatase 1(MKP-1)，schlafen 3，enhancerbinding protein(C/EBP)，Cy

12、clin L1 and V-jun sarcoma virus 17oncogene homolog(avian)。(3)應(yīng)用RT-PCR和real-time PCR檢測1RF-1 mRNA豐度，結(jié)果顯示，體內(nèi)外實驗40 min和3 h，IRF-1 mRNA表達均顯著高于對照組，且實驗3 h，IRF-1 mRNA水平較40 min時明顯增多。與芯片雜交信號強度的Signal Log Ratio(SLR)值趨勢一致。應(yīng)用Western b

13、lotting和免疫組化技術(shù)測定IRF-1蛋白表達水平，結(jié)果表明，體內(nèi)實驗3 h時，腎組織中IRF-1蛋白明顯表達；體外實驗40 min和3 h，sublytic C5b-9刺激的GMCs中IRF-1蛋白水平也顯著高于對照組，另實驗3 h，IRF-1蛋白表達水平較40 min時明顯增多，且主要分布在細胞核內(nèi)。 結(jié)論：Thy-1 N發(fā)病涉及眾多基因的異常表達，而IRF-1基因?qū)儆隗w內(nèi)(Thy-1 N模型)和體外(sublyticC

14、5b-9刺激GMCs模型)同期共表達上調(diào)基因。 第三部分IRF-1在sublytic C5b-9誘導(dǎo)GMCs凋亡中的作用及其機制 目的：從基因水平上探討干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)對sublytic C5b-9誘導(dǎo)GMCs凋亡的影響及其可能涉及的分子機制(或下游通路)。 方法：(1)才艮據(jù)IRF-1基因序列設(shè)計引物，應(yīng)用RT-PCR擴增全長的IRF-1基因，經(jīng)BarnH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后連接到真核表達載

15、pcDNA3.1-myc，構(gòu)建真核達質(zhì)粒pcDNA3.1/IRF-1-myc。并經(jīng)亞克隆，構(gòu)建pcDNA3.1/IRF-1-GFP真核表達質(zhì)粒。(2)體外將pcDNA3.1/IRF-1質(zhì)?；騞ominant negative IRF-1(pcDNA3.1/dnlRF-1)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染GMCs，篩選pcDNA3.1/IRF-1和pcDNA3.1/dnlRF-1轉(zhuǎn)染最佳時間，并將GMCs作相應(yīng)的分組處理。(3)應(yīng)用Hoechst 33342染色

16、檢查各組GMCs的凋亡形態(tài)，流式細胞儀定量分析DNA含量和細胞周期分布；另外ELISA法檢測各組GMCs及其相應(yīng)抗體中和后的GMCs培養(yǎng)上清中干擾素-β(IFN-β)、IFN-γ的含量。此外，利用人工底物法檢查各組GMCs的活性Caspase-3/7水平。 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建pcDNA3.1/IRF-1真核表達質(zhì)粒。(2)Sublytic C5b-9刺激的GMCs和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/IRF-1質(zhì)粒的GMCs均呈現(xiàn)核Hoec

17、hst 33342染色致密增強或碎裂等凋亡形態(tài)學(xué)的改變，DNA組方圖上出現(xiàn)“亞G1”峰，凋亡率增加，細胞周期阻滯在G1期，培養(yǎng)上清中IFN-β、IFN-γ的含量以及GMCs中的活性Caspase.3/7水平明顯升高；pcDNA3.1/IRF-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的GMCs再給予sublytic C5b-9刺激后，上述現(xiàn)象更為明顯。與之相反，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/dnlRF-1質(zhì)粒的GMCs再給予sublytie C5b-9刺激后，凋亡率顯著降低，