暴發(fā)性肝豆狀核變性的臨床、病理和基因突變研究.pdf

1、肝豆狀核變性又稱威爾遜病(Wilson Disease,WD),是一種以銅代謝障礙為特征的常染色體隱性遺傳病。其分子病因為ATP7B基因突變使其表達產物P型銅轉運ATP酶功能缺陷而使膽汁中銅排泄減少,導致肝、腦等組織中銅沉積而產生毒性損傷。臨床表現為廣泛的、異質性的臨床綜合征,包括肝臟、神經、腎臟、角膜等多器官系統(tǒng)損害。暴發(fā)性肝豆狀核變性(Fulminant Wilson Disease,FWD)是WD的一種少見而嚴重的臨床類型,病情兇

2、險,預后極差,如不進行肝移植治療,病死率幾乎為100％。其臨床表現與其他原因引起的暴發(fā)性肝衰竭類似,極易誤診,國內外至今尚未見從臨床、病理和分子生物學多個水平進行追蹤觀察的報道。
　　目的:1、總結FWD患者的臨床特點,探討死亡原因和銅代謝指標的變化規(guī)律,為診斷和治療提供科學依據。2、觀察FWD患者的組織器官(特別是肝臟和腎臟)病理特征,進一步闡明發(fā)病機理,為診斷和治療提供科學依據。3.分析FWD患者的分子生物學特點,檢測基因突變

3、,探討分子病理學機制,為基因診斷提供科學依據。
　　方法:1、系統(tǒng)觀察臨床癥狀與體征,定期檢查三大常規(guī)、肝。腎功能、銅藍蛋白、尿銅、血清銅和影像學檢查等;用裂隙燈顯微鏡進行眼部K-F環(huán)檢查;應用推薦的診斷標準進行診斷。2、通過尸體解剖或活體組織穿刺獲取肝、腎、腦等重要器官組織,進行顯微和超微結構檢查;在特征性沉積顆粒上利用X-射線能譜儀進行點的元素分析。3、采用PCR擴增后直接測序法,檢測患者及家系成員WD基因全長21個外顯子及外

4、顯子/內含子交界區(qū)序列,進行在線序列分析。
　　結果:1、兩例患者均表現為銅藍蛋白降低,24小時尿銅顯著升高,血清游離銅極度升高;一例患者K-F環(huán)陽性,另一例未查,但肝銅顯著升高;根據第八屆WD國際研討會提出的計分診斷標準,分別得5分和7分,符合WD的診斷。既往無肝病史,起病1月后出現嚴重肝功能衰竭,有中度至重度溶血,符合FWD的診斷。2、一例患者以肝病癥狀起病,一例以腎病癥狀起病,均于病后1個月進入肝衰竭末期后方確診,失去了搶救

5、的時機并死亡;兩例患者病后均未及時治療,病例二還使用了對肝臟有明顯毒性的藥物,是引起肝衰竭的重要誘因;兩例患者均出現了感染、出血等多種嚴重并發(fā)癥,是死亡的直接原因。3、兩例患者尿銅分別增加67至252倍,血清游離銅顯著升高。尿銅和血清游離銅顯著升高對診斷FWD極有價值,也是判斷病情輕重和預后的重要指標。4、尸體解剖發(fā)現患者肝臟外觀呈典型的結節(jié)性肝硬化,直接證明至少部分FWD是在肝硬化基礎發(fā)生的嚴重肝損傷。5、光鏡下可見肝細胞大量變性、壞

6、死,胞漿有大量顆粒沉積;電鏡下胞漿有許多細胞器碎片和顆粒狀高電子密度沉積物,線粒體大小、形態(tài)不一;說明銅對肝臟的損害相當嚴重,與目前國內外文獻報道的基本吻合。腎、腦、肺、脾、胰腺、腸道、膽囊、心臟等器官組織均有明顯的病理改變,有褐色顆粒沉積,說明銅對全身多器官系統(tǒng)均有嚴重損害。6、首次在超微病理檢測的基礎上,采用X-射線能譜儀對FWD肝臟組織進行了金屬元素檢測分析,直接證明肝細胞沉積的顆粒中含有大量銅。首次直接證實肝臟細胞沉積的顆粒中含

7、有大量鐵,與近年國外報道的WD患者存在鐵代謝異常結論一致。7、采用21對引物和自行設計的實驗條件,成功地擴增了ATP7B基因全部21個外顯子及外顯子/內含子交界區(qū);瓊脂糖凝膠電泳分析可見PCR產物大小與預期的相同,直接測序結果與基因庫參照序列相同,說明引物設計正確,實驗條件適當,實驗結果可靠。8、與正常ATP7B基因比對分析表明,病例一ATP7B的21個外顯子均未發(fā)現突變;病例二第13號外顯子發(fā)現有一錯義雜合突變:2975C→T突變(P

8、ro992Leu)。這一突變位于ATP7B的通道/磷酸化區(qū)和第6跨膜功能區(qū),該區(qū)域是ATP7B功能所必須的,如發(fā)生突變,勢必影響ATP7B的功能。其父親也有同樣的突變,說明突變來源于父親。該突變國內尚未見報道,提示我國WD的基因診斷不宜只檢測第8、12號外顯子等突變熱區(qū)。該突變是否與暴發(fā)性病變有關,有待進一步證實。
　　結論:1、至少部分FWD是在肝硬化基礎上出現的嚴重肝損傷。誤診是WD發(fā)展成為FWD的重要原因;治療不當,特別是使

9、用肝毒性藥物是加重肝損傷的重要誘因;感染、出血等多種嚴重并發(fā)癥,是死亡的直接原因。為此,要高度重視WD的研究,加強學術交流和專業(yè)培訓,提高認知性和診療水平。2、WD的臨床表現復雜,起病形式多樣,臨床工作中診斷不明的肝病、腎病、溶血等要注意與WD的鑒別。3、尿銅和血清游離銅顯著增高是FWD的重要臨床特點,對診斷和預后判斷有重要意義,降低血清游離銅水平可能是治療的關鍵。4、FWD患者肝、腎、腦、肺、脾、胰腺、心臟等器官組織均有明顯的病理改變

10、和褐色(銅)顆粒沉積,全身多器官系統(tǒng)損害嚴重。5、X-射線能譜儀進行金屬元素檢測分析,不僅直接證明WD肝細胞沉積顆粒中含有大量銅和鐵,與近年國外報道的WD患者存在鐵代謝異常結論一致,也為WD的診斷提出了一種新的方法。6、病例二第13號外顯子發(fā)現一錯義雜合突變,來源于父親,國內未見報道。突變位于ATP7B的通道/磷酸化區(qū)和第6跨膜功能區(qū),可能對其功能有重要影響,是否與暴發(fā)性發(fā)病有關有待進一步證實。7、WD基因非常復雜,目前致病突變檢出率不