哺乳動物工程細(xì)胞懸浮適應(yīng)-可貼壁亞群(HEK293ar)的獲得及其抗失巢凋亡機制研究.pdf

1、目的：
　　通過建立導(dǎo)致HEK293細(xì)胞脫離培養(yǎng)時完全“失巢”的培養(yǎng)模型，首先通過包括電鏡觀察、TUNEL染色、流式檢測、Hoechst33342-PI雙染色等多種方法研究HEK293細(xì)胞在失巢培養(yǎng)條件下發(fā)生的凋亡現(xiàn)象；并經(jīng)過懸浮和貼壁培養(yǎng)的多輪循環(huán)，獲得一種具有懸浮適應(yīng)-可貼壁特性、并且能夠抵御失巢凋亡的HEK293ar亞群，進(jìn)而通過多種方法對該細(xì)胞亞群的失巢凋亡抗性特性進(jìn)行研究，并研究該亞群是否是通過建立細(xì)胞間連接形成細(xì)胞團(tuán)進(jìn)

2、而賦予細(xì)胞失巢凋亡的抗性。其次，基于失巢凋亡抗性亞群具有的失巢凋亡抗性而以細(xì)胞團(tuán)形式生存和可貼壁培養(yǎng)的雙重特點，對其可能在建立新型瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白的可行性和無載體固定化細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)的增殖特性進(jìn)行研究。再次，以在失巢條件下可形成細(xì)胞團(tuán)而生存的失巢凋亡抗性亞群HEK293ar和失巢敏感的親本細(xì)胞HEK293這一對自然細(xì)胞模型研究HAb18G/CD147黏附分子在失巢凋亡抗性細(xì)胞中的表達(dá)差異，并研究其調(diào)節(jié)細(xì)胞間連接的作用，進(jìn)而明確HAb18

3、G/CD147調(diào)節(jié)的細(xì)胞間連接在失巢凋亡抗性調(diào)節(jié)中的作用；同時還研究另外一種黏附分子E-cadherin是否也參與細(xì)胞失巢凋亡抗性的調(diào)節(jié)，并研究這兩個黏附分子在失巢凋亡抗性調(diào)節(jié)中的可能相互聯(lián)系，進(jìn)而研究HAb18G/CD147調(diào)節(jié)的細(xì)胞連接在抑制失巢凋亡信號調(diào)節(jié)通路中的作用和信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。最后，基于失巢條件下，細(xì)胞形態(tài)和骨架發(fā)生的顯著變化，研究失巢敏感HEK293細(xì)胞和抗性亞群HEK293ar細(xì)胞在失巢條件下主要骨架蛋白的重排方式的差異

4、，并研究HAb18G/CD147和骨架蛋白組織分子plectin之間可能的相互作用，進(jìn)而研究HAb18G/CD147是否通過plectin而調(diào)節(jié)骨架重排的可能性。
　　方法：根據(jù)研究目的，實驗內(nèi)容共分為四個部分，實驗操作方法簡述如下。
　　1哺乳動物工程細(xì)胞可貼壁失巢凋亡抗性亞群（HEK293ar）的獲得
　　建立完全失巢培養(yǎng)模型的培養(yǎng)條件，通過電鏡觀察等研究該細(xì)胞在失巢條件下由于發(fā)生失巢凋亡而死亡的時間規(guī)律；通過有限

5、稀釋法獲得HEK293的單細(xì)胞克隆株，分別研究其在失巢條件下的失巢凋亡敏感情況；研究細(xì)胞失巢模型培養(yǎng)和細(xì)胞貼壁培養(yǎng)長時間循環(huán)培養(yǎng)對單克隆細(xì)胞群失巢凋亡抗性的影響，進(jìn)而通過細(xì)胞失巢培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的多輪循環(huán)以獲得具有失巢凋亡抗性的可貼壁細(xì)胞亞群；長時間失巢培養(yǎng)觀察失巢凋亡抗性亞群的細(xì)胞形態(tài)變化，以及不同時間取樣檢測其發(fā)生的失巢凋亡，以驗證其具有失巢凋亡抗性的特性是否穩(wěn)定存在；直接將失巢培養(yǎng)的細(xì)胞群在貼壁條件下培養(yǎng)，觀察細(xì)胞是否還具有重新貼壁

6、培養(yǎng)的特性。最終以獲得一種具有以建立細(xì)胞間連接而成團(tuán)具有失巢凋亡抗性的可貼壁性細(xì)胞亞群。
　　2、抗性細(xì)胞亞群HEK293ar細(xì)胞在瞬時轉(zhuǎn)染法生產(chǎn)蛋白和無載體固定化方面的應(yīng)用研究
　　通過Lipofectin2000試劑分別在失巢敏感細(xì)胞HEK293和抗性細(xì)胞HEK293ar中高效轉(zhuǎn)染pEGFP/N1，懸浮培養(yǎng)研究其在懸浮培養(yǎng)條件下生產(chǎn)蛋白的差異；通過Lipofectin2000試劑在抗性細(xì)胞HEK293ar中轉(zhuǎn)染pEGFP

7、/N1，連續(xù)懸浮培養(yǎng)并每天取樣研究其在懸浮條件下生產(chǎn)蛋白效率的變化。重要的，通過建立高效聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)（PEI）染技術(shù)，建立基于HEK293ar細(xì)胞亞群的高效PEI瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)策略。
　　3、HAb18G/CD147黏附分子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞連接和失巢凋亡抗性的研究
　　以獲得的失巢凋亡抗性亞群HEK293ar和親本細(xì)胞HEK293這對細(xì)胞為模型，通過流式細(xì)胞術(shù)測定和westernblot等方法研究HAb18G/CD147黏附分子的

8、表達(dá)差異，并研究其在懸浮培養(yǎng)抗性細(xì)胞時形成的細(xì)胞團(tuán)中的亞細(xì)胞定位；通過RNAi技術(shù)下調(diào)HAb18G/CD147表達(dá)研究其對細(xì)胞間連接和細(xì)胞凋亡抗性的影響；研究參與調(diào)節(jié)細(xì)胞間連接和凋亡抗性的另外一種黏附分子E-cadherin在這對細(xì)胞間的表達(dá)差異，并通過RNAi技術(shù)研究下調(diào)此蛋白表達(dá)對細(xì)胞間連接和細(xì)胞存活的影響；通過westernblot和免疫熒光法研究下調(diào)HAb18G/CD147對E-cadherin表達(dá)和細(xì)胞生存的影響；通過額外添加

9、EDTA和抗-E-cadherin抗體阻斷細(xì)胞間連接研究封閉或破壞E-cadherin作用對細(xì)胞表達(dá)HAb18G/CD147的影響，并通過RNAi技術(shù)下調(diào)E-cadherin表達(dá)研究其對HAb18G/CD147表達(dá)的影響。通過研究添加LY294002（PI-3K通路信號競爭性抑制劑）和PD98059（ERK通路抑制劑）等信號通路抑制劑對失巢凋亡抗性亞群細(xì)胞增殖和細(xì)胞間連接的影響，研究其參與失巢凋亡抗性調(diào)節(jié)的細(xì)胞主要信號通路。
　　

10、4、失巢凋亡抗性亞群在失巢培養(yǎng)下的細(xì)胞骨架特征和黏附分子HAb18G/CD147之間的關(guān)系研究
　　通過形態(tài)觀察研究抗性細(xì)胞亞群HEK293ar細(xì)胞在失巢條件的細(xì)胞連接和細(xì)胞成團(tuán)現(xiàn)象；研究抗性細(xì)胞在失巢前后的微纖維絲細(xì)胞骨架的特征；通過免疫熒光法研究HEK293ar細(xì)胞在失巢培養(yǎng)下actin(G-或F-)、α-tubulin和plectin的骨架重排特征以及HAb18G/CD147的亞細(xì)胞定位；采用RNAi干涉HAb18G/CD1

11、47表達(dá)研究其對F-actin骨架重排的可能影響；通過免疫熒光法研究失巢凋亡時HAb18G/CD147和plectin參與失巢凋亡調(diào)節(jié)的現(xiàn)象；通過免疫熒光雙標(biāo)記法研究HAb18G/CD147和plectin在失巢培養(yǎng)抗性亞群時的相互作用，通過RNAi下調(diào)HAb18G/CD147研究其對失巢培養(yǎng)時這兩個分子相互作用的可能影響。
　　結(jié)果：
　　1、成功建立了針對失巢培養(yǎng)HEK293細(xì)胞的“完全失巢”模型，并成功用于研究工程細(xì)胞

12、HEK293在懸浮條件下發(fā)生的失巢凋亡。觀察到HEK293細(xì)胞在失巢條件下發(fā)生染色體斷裂、膜發(fā)泡、DNA斷裂、凋亡小體形成和亞二倍體峰等典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。得到八株HEK293細(xì)胞單克隆細(xì)胞，研究得知，親本細(xì)胞是由一群有不同失巢敏感程度的細(xì)胞亞群而組成的。長時間失巢培養(yǎng)有助于提高細(xì)胞的抗失巢凋亡能力。通過利用細(xì)胞失巢培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)循環(huán)獲得了一種具有失巢凋亡抗性以細(xì)胞團(tuán)方式生長的可貼壁細(xì)胞亞群。該亞群具有穩(wěn)定的失巢凋亡抗性和重新貼壁培養(yǎng)的

13、的特性。
　　2、貼壁轉(zhuǎn)染EGFP基因后，抗性細(xì)胞HEK293ar在懸浮條件下培養(yǎng)到第三天時仍然維持著高效生產(chǎn)蛋白的能力，而親本細(xì)胞HEK293則由于發(fā)生失巢凋亡蛋白產(chǎn)率和HEK293ar相比有明顯下降。長時間懸浮培養(yǎng)HEK293ar時，可以維持初始時的高效生產(chǎn)蛋白的能力。利用HEK293ar細(xì)胞進(jìn)行無載體固定化培養(yǎng)時，維持細(xì)胞活性在80-87％，比生長速率達(dá)到0.05-0.06hr-1，此細(xì)胞亞群可以用于無載體固定化培養(yǎng)。建立了

14、基于HEK293ar細(xì)胞亞群的高效PEI轉(zhuǎn)染策略，其轉(zhuǎn)染效率高達(dá)65-75％，而且在懸浮狀態(tài)時可以維持高效生產(chǎn)蛋白的能力。
　　3、利用失巢凋亡抗性細(xì)胞HEK293ar和HEK293細(xì)胞這對自然細(xì)胞研究模型，證實黏附分子HAb18G/CD147內(nèi)源性表達(dá)水平的提高是抗性細(xì)胞具有失巢凋亡抗性的重要原因。下調(diào)HAb18G/CD147可以導(dǎo)致細(xì)胞失巢培養(yǎng)條件下細(xì)胞間連接斷裂以及細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡。成功利用此模型研究證實E-cadherin

15、黏附分子也參與了抗性細(xì)胞的抗性調(diào)節(jié)。下調(diào)HAb18G/CD147可以導(dǎo)致E-cadherin在24hr后逐步降解，細(xì)胞間連接斷裂。利用EDTA溶液以及抗E-cadherin抗體阻斷細(xì)胞間連接對HAb18G/CD147表達(dá)沒有顯著影響，干涉E-cadherin也對HAb18G/CD147表達(dá)沒有明顯影響。用PI-3K通路信號競爭性抑制劑LY294002處理抗性細(xì)胞對抗性細(xì)胞的增殖和細(xì)胞間連接有影響，而用ERK通路抑制劑PD98059處理卻

16、沒有同樣的效果。
　　4、闡明了HEK293ar在失巢培養(yǎng)條件下細(xì)胞間連接加強和微纖維絲骨架重排的現(xiàn)象；抗性細(xì)胞亞群HEK293ar骨架重排在失巢條件下和貼壁下相比呈現(xiàn)紊亂的F-actin排布形式(aberrantcytoskeletondistribution）；通過免疫熒光法研究得知，HEK293ar細(xì)胞在失巢下細(xì)胞骨架蛋白actin、α-tubulin和plectin均呈現(xiàn)紊亂的重排形式，而且和親本細(xì)胞相比，其表達(dá)均有所上調(diào)

17、。下調(diào)HAb18G/CD147導(dǎo)致抗性細(xì)胞HEK293ar失巢條件下的F-actin發(fā)生重排，表達(dá)變?nèi)?，呈現(xiàn)典型的細(xì)胞發(fā)生凋亡時的骨架重排現(xiàn)象，在細(xì)胞邊緣以及表面突起處部分表達(dá)變強；發(fā)現(xiàn)抗性細(xì)胞亞群在失巢培養(yǎng)時，plectin和HAb18G/CD147的表達(dá)存在部分共定位，兩分子在抗性細(xì)胞中的表達(dá)呈正相關(guān)（0

18、p”接近于1；干涉HAb18G/CD147后發(fā)現(xiàn)，兩分子在細(xì)胞內(nèi)的共定位率有明顯減少，“Mander'soverlap”系數(shù)減少，說明其共定位程度減少。Plectin和HAb18G/CD147分子在細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡時參與了凋亡小體的形成。
　　結(jié)論：
　　1、成功獲得具有失巢凋亡抗性的貼壁性HEK293ar細(xì)胞亞群，以用做研究細(xì)胞間連接和工程細(xì)胞團(tuán)生長時的細(xì)胞模型，此細(xì)胞亞群的獲得為建立高效便宜的瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)奠定了細(xì)胞基礎(chǔ)，

19、也是進(jìn)行無載體固定化培養(yǎng)的適宜細(xì)胞亞群。
　　2、成功建立了基于抗性細(xì)胞亞群HEK293ar的雙階段瞬時高效轉(zhuǎn)染生產(chǎn)藥物蛋白策略，證明了此細(xì)胞亞群適宜于用于建立高效轉(zhuǎn)染細(xì)胞生產(chǎn)蛋白平臺，并且也適宜作為一種重要的無載體固定化培養(yǎng)的細(xì)胞亞群。
　　3、利用此模型細(xì)胞研究了HAb18G/CD147黏附分子調(diào)節(jié)的細(xì)胞間連接抑制失巢凋亡抗性的信號通路，得出結(jié)論為：HAb18G/CD147調(diào)節(jié)的細(xì)胞連接是以E-cadherin-PI-3